新型生长抑素DNA疫苗免疫猪的效果及其影响因素和作用机制研究

摘要

本研究应用基因免疫、酶联免疫测定、活体成像和石蜡切片等技术，将新型生长抑素DNA疫苗--减毒鼠伤寒沙门氏菌株CS022(pGM-CSF/SS)口服和鼻腔免疫仔猪，探讨其免疫效力及影响因素；另将减毒猪霍乱沙门氏菌株C500(pGS/2SS-M4GFP-asd)肌肉注射小鼠，探讨外源目的基因在组织器官中表达与分布的时空变化规律，为优化新型DNA疫苗的免疫程序，提高其对仔猪的促生长效果，加快其临床应用奠定基础。
　　 1.仔猪口服新型生长抑素DNA疫苗的免疫应答及其促生长效果
　　 为了探索疫苗能否诱导仔猪产生免疫应答反应及其促生长效果，将40只9周龄的杜-长-大三元杂交猪随机分为4组，每组10只，公母各半。第1～3组(T1-T3)经口灌服低(5×108 CFU/只)、中(5×109CFU/只)、高(5×1010 CFU/只)三个剂量的减毒鼠伤寒沙门氏菌株CS022(pGM-CSF/SS)生长抑素DNA疫苗，第4组灌服5ml PBS溶液，用做对照(C1)。1W后以相同方式和剂量加强免疫1次。分别在免疫前、初免后4W、初免后8W称重3次；于免疫前及免疫后SW2次前腔静脉采集血样，用间接ELISA法检测血浆IgG抗体水平，用放射免疫法检测血浆中的SS浓度。
　　 结果显示，免疫后仔猪行为正常，受试猪血浆中均能检测到SS抗体，以T3组抗体水平最高；与C1组相比，T1组(P>0.05)差异不显著，T2组(p<0.01)差异极显著，T3组(p<0.01)差异极显著。T3组与T1组相比(p<0.01)，差异极显著。试验各组出现的免疫阳性猪比例，其中T1、T2组均为10.0%，T3组为40.0%。试验各组血浆SS浓度与免疫前和C1组相比均大大降低(P<0.01)，差异极显著，但组间差异不显著。
　　 免疫后0～4W，仔猪日增重T3组比C1组提高20.69%(P<0.05)，差异显著，比T1组提高27.59%(P<0.01)，差异极显著，比T2提高13.79%(P>0.05)，差异不显著；T2组分别比C1组、T1组提高6.90%、13.80%(P>0.05)，差异不显著。免疫后5～8W，仔猪日增重T1组比C1组提高11.11%(P>0.05)，T2组和T3组比C1组均提高2.47%(P>0.05)，差异不显著。免疫后0～8W，仔猪平均日增T3组比C1、T2、T1组分别提高10.00%、5.71%、7.14%(P>0.05)，差异不显著。
　　 以上结果表明，新型生长抑素DNA疫苗可诱导仔猪产生高水平免疫应答反应，有效促进了仔猪生长；免疫后仔猪SS抗体水平、抗体阳性猪所占比率和平均日增重均与免疫剂量存在正相关关系。
　　 2.仔猪鼻腔免疫新型生长抑素DNA疫苗的促生长效果
　　 为了探索鼻腔免疫新型生长抑素DNA疫苗对仔猪的促生长效果，将75只遗传背景、年龄一致，体重21.0±2.0Kg杜长大三元杂交阉公猪分成4组，前3组(T4～T6)每组20只，鼻腔免疫3次，每次间隔4W，剂量分别为低(2×108 CFU/只)、中(2×109CFU/只)、高(2×1010 CFU/只)，第4组(C2)15只，鼻腔给药PBS溶液，剂量为2ml，用做对照。分别在免疫前、免疫后12W称量体重。结果显示，3个免疫组(T4～T6)平均日增重较对照组(C2)分别提高11.11%、6.17%、1.23%(P>0.05)，差异不显著。随着免疫剂量的升高，平均日增重呈下降趋势，表明鼻腔免疫效果与剂量之间存在负相关关系。在日增重提升幅度一致情况下，鼻腔免疫需要的疫苗剂量远远少于口服免疫。
　　 3.新型生长抑素DNA疫苗肌肉注射小鼠后目的基因表达与蛋白分布的时空变化规律
　　 为了探索肌肉注射新型生长抑素DNA疫苗小鼠器官组织SS融合蛋白的时空变化规律，将78只7周龄昆明小鼠随机分为13组，每组6只，雌雄各半，采用肌肉纵向两点注射法在小鼠2个后肢股四头肌接种，剂量为150μL×109CFU/只。6个免疫组(A1～A6)免疫减毒猪霍乱沙门氏菌C500(pGS/2SS-M4GFP-asd)生长抑素DNA疫苗，6个阴性对照组(B1～B6)免疫不含质粒的C500空菌疫苗，1个组注射150μLPBS溶液，用于空白对照(C3)。分别于免疫后24 h、48h、96 h、144h、192h、240h6个时间点依次用乙醚熏晕处死A1～A6和B1～B6组的6只小鼠，C4组小鼠于注射24h处死，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和后腿肌肉样品制作石蜡切片，并用免疫组化法染色切片。
　　 结果显示，仅在注射处肌肉、脾脏、肝脏组织中的巨噬细胞依次表达SS蛋白，并在144h到达峰值。肌肉组织最先(24h)表达，持续时间最长，240h仍有大量SS蛋白；脾脏次之，免疫48h开始表达，持续时间居中，240h只有少量SS蛋白；肝脏最晚(144h)表达，持续时间最短，240h已观察不到SS蛋白。结果表明肌肉注射免疫是可行的，外源DNA质粒在动物体内存留和目的蛋白持续表达的时间短暂，在家畜生产中可以应用肌肉注射方式免疫生长抑素DNA疫苗。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略词表

研究目的与意义

第一章 文献综述--生长抑素DNA疫苗研究进展

1 生长抑素DNA疫苗的种类

1.1 单拷贝生长抑素-乙肝表面抗原融合表达质粒

1.2 双拷贝生长抑素-乙肝表面抗原融合表达质粒

1.3 GM-CSF生长抑素融合表达质粒

1.4 染色体-质粒平衡致死系统生长抑素融合表达质粒

2 提高生长抑素DNA免疫效果的方法

2.1 免疫方式

2.2 免疫剂量

2.3 免疫次数

2.4 免疫佐剂

3 降低生长抑素DNA疫苗成本、提高接种操作简便性的方法

3.1 注射

3.2 口服

3.3 鼻腔给药

3.4 组合接种

4 生长抑素DNA疫苗的安全性

4.1 DNA残留

4.2 DNA整合

4.3 自身免疫性疾病

4.4 生殖毒性

4.5 免疫耐受

4.6 辅助因子和佐剂的副作用

4.7 环境安全

5 生长抑素DNA疫苗免疫机制研究进展

5.1 基因表达

5.2 免疫应答

5.3 免疫中和

结语

第二章 仔猪口服新型生长抑素DNA疫苗的免疫应答反应和促生长效果研究

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 仔猪行为观察结果

2.2 ELISA检测结果

2.3 血浆SS浓度

2.4 体重称量结果

3 讨论

3.1 仔猪的免疫应答反应

3.2 疫苗促生长的效果

第三章 仔猪鼻腔免疫新型生长抑素DNA疫苗的促生长效果

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 仔猪行为观察结果

2.2 体重称量结果

3 讨论

3.1 鼻腔免疫的促生长效果

3.2 鼻腔免疫与口服免疫的优劣

第四章 新型生长抑素DNA疫苗肌肉注射小鼠后目的基因表达与蛋白分布的时空变化规律

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 小鼠行为与生理观察结果

2.2 组织切片观察结果

3 讨论

全文讨论与结论

1 讨论

2 结论

2.1 疫苗免疫效应显著

2.2 口服和鼻腔免疫提高了仔猪的生长速度，后者较前者效力高

2.3 初步探明了肌肉注射接种疫苗后目的基因表达与蛋白分布的时空变化规律，进一步证实肌肉注射免疫是可行和安全的

创新与不足

参考文献

已发表研究论文

已授权和申请的国家发明专利

Curriculum Vitae

致谢