非抗性筛选生长抑素DNA疫苗免疫育肥猪的临床试验效果和安全性研究

摘要

前期研究证明，重组菌C500(pVGS/2SS-asd)基因疫苗免疫可以促进小鼠生长，并且对小动物无不良影响。为了进一步了解该疫苗对大动物的免疫效果及其机制和安全性，本研究选择78头80日龄的杜长大育肥猪，随机分成6组，用同一剂量(5×1011CFU/头)三种免疫方式（口腔+鼻腔、口腔、鼻腔）、同一免疫方式（口腔+鼻腔）三种剂量（高5×1011 CFU/头、中5×1010 CFU/头、低5×109 CFU/头）进行临床试验，试验期90 d，探讨最适免疫方法和免疫剂量。采用美国奥饲本(OSBORNE)公司生产的投料器和种猪生产性能WINFIRE测定系统每天自动记录实验猪的饲料消耗量、测定猪体重，饲料报酬以评定基因疫苗免疫效果;从免疫后猪的日常行为及体温是否正常、应用目的基因扩增等方法从基因整合、环境扩散等方面评价疫苗的安全性;应用ELISA方法测定抗体和激素水平，以探讨其作用机制。结果如下:
　　1.促生长效果及饲料报酬采用美国奥饲本公司生产的种猪生产性能WINFIRE测定系统每天全自动记录猪采食量和体重数据，免疫前期育肥猪生长速度较快，后期增重减缓;探究免疫方式对育肥猪的促生长效果，结果表明，各时期试验组日增重均高于对照组，免疫后4-7 w，喷鼻组日增重显著高于对照组（P＜0.05）;探究免疫剂量对育肥猪的促生长效果，结果表明，与对照组相比，初免疫后7 w，中剂量、低剂量组日增重均提高19.94％，差异极显著(P＜0.01)，整个试验阶段，各免疫组的平均日增重均高于对照组，而低剂量组的日增重比对照组提高9.41％，差异显著(P＜0.05)。
　　免疫方式组、免疫剂量组的日采食量相比对照组均有所增加，但无明显差别;不同免疫方式组间，鼻腔组的料肉比低于对照组（P＞0.05），不同免疫剂量组间，低剂量组的料肉比低于对照组(P＞0.05)。
　　2.安全性研究本研究从免疫后猪的日常行为、基因整合情况、环境污染三个方面评估重组菌C500(pVGS/2SS-asd)的安全性，结果显示，所有试验猪免疫后采食、饮水、粪便情况、精神状态等日常行为和体温均正常，初步证明该疫苗的安全性;免疫后12w（即出栏时）采集每头猪的心、肝、肺、肌肉、脂肪组织并提取DNA，经PCR方法检测，所有组织中均未检测到目的基因GS/2SS，结果提示，该质粒没有整合至动物的基因组中;在每次免疫后第1、3、5、7、10、15、20、30d采集所有试验猪的粪样、水样、猪舍前后5m的土壤样本，用麦康凯选择培养基培养，挑选可疑菌落进行PCR检测，所有样本均未扩增出目的基因GS/2SS，表明生长抑素基因疫苗没有造成环境污染。
　　3.免疫应答反应探究免疫方式（口腔+鼻腔、口腔、鼻腔）对育肥猪的免疫效果，研究表明，三种免疫方式均诱导机体产生免疫应答，口腔+鼻腔组和口腔组的抗体水平显著高于对照组（P＜0.05），且口腔+鼻腔组显著高于口腔组，提示口腔+鼻腔的免疫方式可以诱导更高水平的免疫应答;探究免疫剂量（高5×1011 CFU/头、中5×1010 CFU/头、低5×109 CFU/头）对育肥猪免疫效果的结果显示，低剂量组体现了更好的免疫效果，其抗体水平显著(P＜0.05)高于对照组，生长激素水平高于对照组，但差异不显著(P＞0.05)。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 生长抑素基因疫苗的研究进展

1．1．1 单拷贝基因

1．1．2 双拷贝基因

1．1．3 非抗性筛选双拷贝质粒

1．1．4 生长抑素载体的研究

1．2 生长抑素基因疫苗对动物生长性能方面等影响

1．2．1 对小动物的促生长影响

1．2．2 对畜禽生长性能的影响

1．3 育肥猪性能测定的关键技术

1．4 生长抑素基因疫苗免疫程序的优化

1．4．1 口腔免疫

1．4．2 鼻腔免疫

1．4．3 免疫剂量

1．4．4 加免次数

1．5 安全性研究

1．5．1 基因整合

1．5．2 基因免疫对受试动物的影响

1．5．3 环境的安全性研究

1．6 研究目的和意义

2 材料

2．1 实验菌株

2．2 主要药品和试剂

2．3 主要仪器设备

2．4 试剂的配制

3 方法

3．1 pVGS／2SS-asd质粒的转化

3．2 质粒的小量提取

3．3 质粒的酶切鉴定

3．4 疫苗制备

3．5 实验动物饲养管理

3．5．1 实验猪分组

3．5．2 育肥猪的称重及血液、组织样采集

3．6 抗SS抗体和GH激素检测

3．6．1 抗生长抑素抗体的检测

3．6．2 生长激素检测

3．7 组织DNA提取

3．8 猪舍周围环境样品采集与目的基因检测

3．9 数据分析

4 结果与分析

4．1 pVGS／2SS-asd质粒的双酶切产物

4．2 免疫对育肥猪的促增重效果

4．2．1 免疫剂量对育肥猪日增重的影响

4．2．2 免疫方式对育肥猪日增重的影响

4．3 免疫对育肥猪日采食量、料肉比的影晌

4．3．1 育肥猪的日采食量

4．3．2 育肥猪的料肉比

4．4 安全性研究

4．4．1 免疫对试验猪日常行为及体温的影响

4．4．2 组织的目的基因整合

4．4．3 环境安全性

4．5 免疫后生长抑素抗体水平

4．6 生长激素的分泌水平

5 讨论

6 结论

6．1 全文结论

6．2 全文创新

6．3 全文不足

参考文献

致谢

附录