猪骨骼肌特异性表达基因myoz1/tnnc2启动子的克隆及功能验证

摘要

启动子是一段能起始下游基因转录的DNA调控序列，选择合适的启动子可以驱使目的基因在特定的组织表达，如消化道特异性启动子驱动植酸酶基因在消化道内表达或骨骼肌特异性启动子驱动脂肪相关基因在肌肉中表达。PPARγ(PeroxisomeProliferator-Activated Receptorsγ)基因作为研究肌内脂肪含量的候选主效基因，能调控脂肪细胞的分化及脂肪沉积。因此，设想通过肌肉组织特异性启动子提高PPARγ在肌肉中的表达，增加肌肉中脂肪的沉积，以提高肌内脂肪的含量。本研究通过克隆，筛选及功能验证肌肉组织特异性表达基因myoz1(Myozenin1)和tnnc2(FastSkeletal Muscle Troponin C)的启动子区域，获得具有肌肉组织特异性调控功能的核心启动子，再利用核心启动子成功调控外源基因PPARγ在成肌细胞中表达，为构建转基因小鼠模型提供一定的理论基础。取得结果如下:
　　 (1)根据进化印记法理论，采用软件MEME分析myoz1及tnnc2的调控区域，发现myoz1调控区域的保守序列集中在第一外显子5'端附近，而tnnc2调控区域的保守序列集中在第一外显子5'端上游的2000 bp左右。
　　 (2)根据MEME分析结果，将myoz1及tnnc2启动子区域分别限制在-1885～+170和-2131～+182处。通过在线软件TFSEARCH分析启动子区域可能存在的转录因子结合位点，发现myoz1启动子含有TATA-box结构，而tnnc2启动子无TATA-box，还发现多个与肌肉功能相关的转录因子结合位点如MyoD、MEF-2等。根据预测结果设计myoz1、tnnc启动子的缺失片段。
　　 (3)构建启动子及缺失片段重组质粒，通过细胞水平的瞬时转染，发现猪myoz1肌肉组织特异性的核心启动子位于-478～+170之间，其转录活性是阴性对照的3倍;猪tnnc2的肌肉组织特异性核心启动子区域位于-2131～-1083之间，其转录活性是阴性对照的8倍左右。随后，构建EGFP表达载体，通过荧光倒置显微镜观察细胞发光情况，发现两个基因的核心启动子均能驱动报告基因EGFP在C2C12细胞中表达。
　　 (4)构建myoz1、tnnc2核心启动子与猪PPARγ基因的重组表达载体，通过定量PCR及western blot检测PPARy在C2C12细胞中的表达。结果表明，在myoz1和tnnc2核心启动子的驱动下，PPARγ基因RNA水平的表达量提高了2倍和3倍左右，且猪PPARγ蛋白能够在C2C12细胞中成功表达。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 启动子概述

1．1 启动子的分类

1．2 核心启动子调控元件的结构

1．3 其它重要调控元件的结构

2 启动子的研究方法

2．1 基于常规试验的研究方法

2．2 基于生物信息学理论的启动子分析方法

3 myoz1及tnnc2启动子研究现状

3．1 myoz1启动子研究现状

3．2 tnnc2启动子的研究现状

4 PPARγ的概述

5 研究目的及意义

第二章 材料与方法

1 试验材料

1．1 DNA样品

1．2 载体和菌株

1．3 试剂及其配置

1．4 主要数据库及分析软件

2 试验方法

2．1 猪myoz1和tnnc2基因启动子的克隆及重组表达质粒的构建

2．2 细胞培养及诱导分化

2．3 细胞转染及双荧光素酶活性的测定

2．4 pEGFP-N1重组表达质粒的构建

2．5 增强型绿色荧光蛋白表达的观测

2．6 核心启动子与PPARγ基因的重组构建

2．7 C2C12细胞的PPARγ表达量测定

2．8 PPARγ重组表达质粒的线性化

第三章 结果与分析

1 猪myoz1和tnnc2启动子功能分析及验证

1．1 猪myoz1和tnnc2启动子的生物信息学分析

1．2 猪myoz1和tnnc2启动子的克隆及缺失重组质粒的构建

1．3 C2C12细胞的诱导分化

1．4 猪myoz1和tnnc2启动子及缺失重组质粒的双荧光素酶活性检测

1．5 pEGFP-N1重组质粒的构建及绿色荧光蛋白的检测

2 猪PPARγ表达载体的构建及表达量的测定

2．1 猪PPARγ表达载体的构建

2．2 定量PCR检测C2C12细胞中PPARγ的表达量

2．3 western blot检测PPARγ蛋白的表达

第四章 讨论

1 进化印记法分析启动子

2 猪myoz1及tnnc2启动子在小鼠C2C12、分化后的C2C12、3T3-L1细胞中的活性分析

3 tnnc2启动子可能存在的一段增强子序列

4 MEF-2、MyoD影响myoz1及tnnc2的启动子活性

5 增强启动子活性以提高外源PPARγ的表达

第五章 小结

1 本研究取得的成果

2 下一步工作计划

参考文献

附录一：猪myoz1基因核心启动子序列

附录二：猪tnnc2基因核心启动子序列

致谢