猪骨骼肌特异性表达基因tnnc2启动子的克隆及应用

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪的骨骼肌特异性表达基因tnnc2的不同长度启动子区域的分离鉴定和功能验证。从猪基因组中克隆了骨骼肌特异表达基因tnnc2上游五个不同长度的启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5所示；结果表明2313bp的tnnc2-pro和1048bp的tnnc2-Q2片段具有独立的启动活性兼肌肉组织特异性，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。公开了五个不同缺失启动子片段制备方法、双荧光素酶活性检测系统和定量PCR方法对启动子活性分析的应用。

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪骨骼肌特异性表达基因tnnc2的不同长度启动子 区域的分离鉴定及功能验证。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表 达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻 译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件， 是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，可与众多的转录因子相互作用调控基因的表达(武力1999)。 因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等有利于我们更好的理解相应基因的功能及基因间的互作 关系。

启动子分类方法较多，根据启动子的功能及作用方式可以分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱 导型启动子；根据启动子的结构及位置可以分为核心启动子、近端启动子及远端启动子(Wang and  Hannenhalli2006；Reddy et al2003；Aneia et al2008)；根据核心启动子的结构又可以分为集中型启动子和 分散型启动子。尽管启动子的分类多种多样，对于真核生物而言，RNA聚合酶II型启动子起着主要作 用(Sandelin et al2007)。在组织特异性启动子调控的基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并 表现出发育调节的特征。具备高转录活性的组织特异性启动子是基因工程中的理想启动子，这类启动子 既能高效启动外源基因表达，又能使外源基因在特定的靶细胞或靶组织中表达，这比现阶段广泛利用的 CMV和SV40启动子更具有研究和实用价值。

组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定 位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同 时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病治疗方面的前景尤其可观。其次，转基因动 物育种研究中，通过组织特异性启动子调控外源目的基因在靶组织中表达，能够有效改善动物的某些性 状，如肌内脂肪；或改善动物的消化系统以减少排泄物中的氮磷含量等。鉴于此，组织特异性启动子在 基因工程和转基因育种中越来越受到研究者的青睐。

快肌肌钙蛋白C(TNNC2)是肌钙蛋白C(TnC)一种异构型。肌钙蛋白C可通过本身具有的Ca²⁺结合位点，与Ca²⁺结合后引起肌肉收缩并释放能量和CREB，CREB通过启动核内的c-myc和其他原癌 基因单独或协同调控肌蛋白的形成，从而开始肌纤维的生长分化。Gahlmann对人类的快肌肌钙蛋白C 和慢肌肌钙蛋白C表达差异的研究发现，快肌肌钙蛋白C基因仅在类似骨骼肌快肌的高纤维型肌肉中表 达，而在慢肌和心肌中不表达(Gahlmann1988)。小鼠和人tnnc2基因研究结果发现，两者的编码区长度 部是480bp，编码160个氨基酸，都拥有6个外显子和5个内含子(Tiso et al1997)。研究表明，猪tnnc2 基因位于17号染色体，全长1143bp，含有5个外显子和4个内含子，编码区长度为483bp，编码160 个氨基酸，通过RT-PCR分析发现tnnc2基因仅在猪骨骼肌，如肱二头肌、股四头肌和背最长肌中表达， 在其他组织不表达或者低表达(田兴国2006)。

到目前为止，未见到研究猪骨骼肌特异性表达基因tnnc2的启动子功能的相关报道。所以申请人对 这个基因的启动子进行了不同长度片段的功能研究，以期能够更好地利用该启动子。

发明内容

本发明的目的在于分离、筛选猪骨骼肌特异性表达基因tnnc2启动子的不同片段，并对其进行功能 验证，以期获得此基因具备启动活性并保持肌肉组织特异性的调控区段，为动物基因工程提供可利用的组 织特异性启动子。

本发明从大白猪的基因组中分离并鉴定出tnnc2基因具有肌肉组织特异性的启动子。以大白猪的血 液基因组DNA为模板扩增获得了2313bp、1237bp、1048bp、484bp、338bp共5个不同长度的启动子片 段，将这些片段融合报告基因萤火虫荧光素酶基因(简称LUC基因)构建pGL3-tnnc2-pro、pGL3- tnnc2-Q1、pGL3-tnnc2-Q2、pGL3-tnnc2-Q3、pGL3-tnnc2-Q4真核表达载体5个，将这些载体分别转染 C2C12、3T3-L1及分化的C2C12细胞，通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对 活性，从而获得保持肌肉组织特异性的核心启动子区，进一步构建核心启动子与猪PPARγ基因的重组载 体，通过荧光定量PCR检测PPARγ的表达量。

本发明通过以下技术实现：

本发明的技术路线见图1所示。

利用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索获得猪骨骼肌特异性基因tnnc2的调控序列， 利用MEME、TFSEARCH及MethPrimer生物信息学软件预测全长启动子的大致区域、顺反式作用元件 及CpG岛分布情况。根据预测结果设计5对引物(其核苷酸序列见表1)，从大白猪的基因组中PCR扩 增获得肌肉组织特异性启动子，申请人将扩增的启动子片段分别命名为tnnc2-pro、tnnc2-Q1、tnnc2-Q2、 tnnc2-Q3、tnnc2-Q4，其片段长度分别为2313bp、1237bp、1048bp、484bp、338bp，其核苷酸序列分别 如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示。构建报告基因 LUC融合载体，申请人将其分别命名为pGL3-tnnc2-pro、pGL3-tnnc2-Q1、pGL3-tnnc2-Q2、pGL3-tnnc2-Q3、 pGL3-tnnc2-Q4。瞬时转染C2C12、3T3-L1及分化的C2C12细胞，双荧光素酶报告系统检测发现 pGL3-tnnc2-pro、pGL3-tnnc2-Q1、pGL3-tnnc2-Q2、pGL3-tnnc2-Q4在C2C12细胞中均存在不同程度的 转录活性，在3T3-L1细胞中仅有pGL3-tnnc2-Q1存在微弱的活性。在分化后的C2C12细胞中， pGL3-tnnc2-pro活性有极大的提高，而pGL3-tnnc2-Q1和pGL3-tnnc2-Q2的活性减少，pGL3-tnnc2-Q4 的活性降至与阴性对照一致。结果显示2313bp的全长启动子tnnc2-pro和1048bp的tnnc2-Q2片段具备 独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。将序列相对较短的tnnc2-Q2片段 作为核心启动子，构建与脂肪沉积相关的猪PPARγ基因的重组表达载体，申请人将构建好的载体命名为 pGL3-tnnc2-Q2-PPARγ。将pGL3-tnnc2-Q2-PPARγ转染C2C12细胞，荧光定量PCR检测猪PPARγ基因 的表达。结果发现，tnnc2-Q2能够提高C2C12细胞中PPARγ基因的表达量3倍左右，证明分离出的核 心启动子tnnc2-Q2兼备启动荧光素酶报告基因和脂肪相关基因的能力。

本发明的具体步骤如下：

通过美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找猪tnnc2基因，该基因序 列如SEQ ID NO：6所示，以该基因mRNA5′端上游3000bp至下游第一内含子的序列作为调控区域， 以此序列作为研究对象，利用MEME多序列比对软件对其进行分析，确定全长启动子区域，如SEQ ID NO：1所示。再根据TFSEARCH及MethPrimer预测顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测 的结果设计引物，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增获得5个不同长度的启动子区域，序列分别 如序列表SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5所示。将这些启动子候选片段装载到pGL3-basic报告基因LUC 上游多克隆位点处，装配成融合表达载体(图3)。通过Fugene HP转染将融合表达载体瞬时转入C2C12、 3T3-L1及分化的C2C12细胞，同时转入海肾荧光素酶报告基因pRL-TK为内参质粒。本发明设置阴性 对照pGL3-basic(图2)，阳性对照pGL3-control。转染48h后通过双荧光素酶报告系统对报告基因LUC 进行定量分析，进而考察验证该启动子的不同缺失片段在不同来源细胞中的启动功能。进一步，将获得 的核心启动子连接猪PPARγ的CDS区域，构建重组表达载体，猪PPARγ的CDS区域序列如SEQ ID NO： 7所示。重组载体转染C2C12细胞48h后，提取细胞RNA，通过荧光定量PCR检测PPARγ在C2C12 细胞中的表达量，以此来证明骨骼肌特异性的核心启动子不仅能够启动报告基因表达，同时也具备启动 脂肪相关基因表达的能力。

本发明的优点在于：

(1)本发明详尽的验证了猪tnnc2启动子的各个区段在不同来源细胞中启动基因表达的能力，为 tnnc2基因的表达调控带来了更深层次的认知。

(2)本发明鉴定了肌肉组织特异表达的启动子猪tnnc2的核心区段，为基因工程和分子育种提供了 新的特异表达的启动子资源。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》的内容。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1本发明克隆的猪骨骼肌特异表达基因tnnc2的全长启动子序列tnnc2-pro，长 度为2313bp。

序列表SEQ ID NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子tnnc2-Q1 的核苷酸序列，长度为1237bp。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子tnnc2-Q2 的核苷酸序列，长度为1048bp。

序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子tnnc2-Q3 的核苷酸序列，长度为484bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子tnnc2-Q4 的核苷酸序列，长度为338bp。

序列表SEQ ID NO：6是本发明作为探针的猪骨骼肌特异表达基因tnnc2的全长序列，长度为1143bp， 猪tnnc2基因的Genebank登录号为414905。

序列表SEQ ID NO：7是本发明克隆的猪PPARγ基因CDS序列(猪PPARγ基因的Genebank登录号 为397671)，长度为1515bp，编码504个氨基酸。

图1：本发明的技术路线图。

图2：表达载体pGL3-basic结构示意图，在多克隆位点的下方包含报告基因luc+。

图3：构建好的以pGL3-basic为骨架的融合载体简图。骨骼肌特异表达基因tnnc2的启动子系列缺 失片段来驱动LUC基因表达，由图中的deleted promoter来表示。Amp为氨苄抗性筛选基因；luc+为报 告基因萤火虫荧光素酶；箭头方向表示基因或启动子表达的方向。

图4：融合载体的Mlu I和Nhe I双酶切鉴定图。M表示DL marker2000，1-5分别表示融合载体 pGL3-tnnc2-Q1、pGL3-tnnc2-Q2、pGL3-tnnc2-Q3、pGL3-tnnc2-Q4、pGL3-tnnc2-pro的双酶切结果，上 面较大的条带为载体条带，下端为缺失启动子条带，条带长度分别为1237bp、1048bp、484bp、338bp、 2313bp。

图5：由骨骼肌特异表达基因tnnc2的系列缺失启动子驱动LUC基因在不同来源的细胞中的表达情 况。

图6：载体pcDNA-3.1-PPARγ结构示意图。

图7：重组表达质粒pGL3-tnnc2-Q2-PPARγ的结构示意图。

图8：重组表达质粒pGL3-tnnc2-Q2-PPARγ的PCR鉴定图。M表示DL marker2000，1代表PPARγ 基因的CDS区域，2表示tnnc2-Q2片段。

图9：定量PCR测定PPARγ基因在C2C12细胞中的表达量。

具体实施方式

实施例1：猪的骨骼肌特异性表达基因tnnc2的启动子候选片段及相应缺失片段的获得

利用报道的猪的tnnc2基因的DNA序列(GenBank登录号：414905)为探针序列，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提取候选基因mRNA5′端上游3000至第一内含子的区域作为调控区域。 利用MEME预测功能性的全长启动子区域、通过TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件预测核 心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计全长启动子及3′端缺失 片段的引物(引物序列如表1所示；PCR反应参数设置如表2所示)。其中tnnc2-pro-F表示5个启动子 片段的公共前引物，添加酶切位点Mlu I(ACGCGT，以下划线表示)，携带保护碱基CG(阴影表示)； tnnc2-pro-R、tnnc2-Q1-R、tnnc2-Q2-R、tnnc2-Q3-R、tnnc2-Q4-R分别表示5个启动子片段的后引物，添 加酶切位点Nhe I(GCTAGC，以下划线表示)，携带保护碱基CTA(阴影表示)。以大白猪的血液基因 组DNA为模板，PCR先扩增全长启动子序列tnnc2-pro，扩增产物经过1.5％琼脂糖电泳检测及Omega 公司回收试剂盒纯化回收后，当做缺失启动子的模板，放至-20℃备用。

表1：猪tnnc2启动子缺失载体引物的设计

表2PCR扩增参数

实施例2：猪的骨骼肌特异性表达基因tnnc2的启动子及相应缺失片段的转染载体构建。

(1)限制性内切酶Mlu I和Nhe I酶切载体pGL3-basic(载体购自普洛麦格(北京)生物技术有限 公司，即美国Promega公司，载体及多克隆位点等信息见图2)及各个启动子片段的回收产物tnnc2-pro、 rnnc2-Q1、rnnc2-Q2、rnnc2-Q3、tnnc2-Q4。酶切体系为：

37℃酶切6h后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并回收目的片段：pGL3-basic回收较大的片 段，tnnc2-pro、tnnc2-Q1、tnnc2-Q2、tnnc2-Q3、tnnc2-Q4回收相应大小的片段。用Omega公司的胶回 收试剂盒回收(按该试剂盒的说明书操作)，置于-20℃冰箱保存。

(2)将酶切回收的启动子片段连接到pGL3-basic载体上(见图3)，连接体系见表3。

表3连接体系

16℃水浴过夜连接，将其转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上筛选阳性单 克隆，对重组子进行PCR及酶切鉴定，将阳性重组子挑出送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。对于测 序正确的阳性克隆按原菌液∶培养基体积比＝1∶100的比例进行扩大培养，37℃摇床摇16h后用OMEGA 公司生产的可用于细胞转染的质粒小量抽提试剂盒(D6950-01)抽提质粒，按该试剂盒的说明书操作， 分别命名为pGL3-tnnc2-pro、pGL3-tnnc2-Q1、pGL3-tnnc2-Q3、pGL3-tnnc2-Q4。用Mlu I、Nhe I双酶 切鉴定抽提的质粒，酶切体系如上所述，此时质粒只需加1μL，酶切结果见图4，置于-20℃冰箱备用。

实施例3：启动子及缺失片段重组质粒的细胞转染

本发明用24孔细胞培养皿做转染用。为了消除实验的误差，每个重组载体均进行3次独立的试验， 每次试验做3个重复。根据Fugene HD(Roche公司)说明书操作，每孔按载体的质量：转染试剂的体 积＝0.5μg：1.5μL的比例转染。转染的受体为不同来源的细胞，主要包括小鼠肌源细胞系C2C12(购自 中国科学院细胞库)、小鼠前体脂肪细胞3T3-L1(购自中国科学院细胞库)及用2％的马血清诱导C2C12 细胞(购自中国科学院细胞库)分化形成的肌管。重组载体(pGL3-tnnc2-pro、pGL3-tnnc2-Q1、 pGL3-tnnc2-Q2、pGL3-tnnc2-Q3、pGL3-tnnc2-Q4)转染入细胞48h后收集细胞裂解液后利用双荧光素 酶检测系统对缺失启动子的活性进行分析。本发明的细胞培养、诱导分化、转染的主要步骤及各种溶液 的配制如下所述：

(1)主要溶液的配制

1)细胞生长液(10％浓度的胎牛血清培养基FBS)：将胎牛血清(购自GIBCO公司)放置于4℃ 冰箱融化，待其完全融化后，吸取10mL胎牛血清移入100mL的DMEM/F12培养基(购自HyClone 公司)，0.25μm滤器过滤后置4℃冰箱备用。

2)分化培养液(2％浓度的马血清培养液)的配制：将马血清(购自GIBCO公司)放置于4℃冰 箱融化，待其完全融化后，吸取2mL的马血清，加入100mL的DMEM培养基(购于HyClone公司)， 0.25μm滤器过滤后置于4℃冰箱备用。

3)细胞冻存液：二甲基亚砜(DMSO)、DMEM/F12低糖培养基、胎牛血清三者体积比为1∶4∶5， 配好的冻存液冻存于-20℃。

(2)细胞的常规培养

1)根据细胞的生长状况更换培养液，一般1或2天更换一次；

2)细胞生长密度至80％以上时可进行传代，用吸管吸出旧的培养液，用磷酸盐缓冲液，即PBS(购 自HyClone公司)冲洗两次。将37℃预热的0.25％胰蛋白酶(购自GIBCO公司)加入培养瓶，一般50 cm2细胞培养瓶加入400μL即可，将胰酶铺平细胞瓶底以覆盖所有细胞，室温放置15s-30s后吸出胰酶；

3)轻轻拍打细胞瓶侧壁30s-60s，使细胞从瓶壁脱落，及时加入一定量的新鲜10％FBS培养液， 将贴在瓶壁的细胞冲洗下来并终止胰酶作用；

4)用吸管轻吹未冲洗下来的贴壁细胞，使瓶壁上的细胞完全脱离形成细胞悬液，尽量避免气泡的 产生；

5)吹打细胞均匀后，吸出1/2或者1/3的细胞悬液移入新的细胞瓶中，轻轻摇匀后放入37℃，5％ CO₂培养箱培养。

(3)对C2C12细胞进行诱导分化

当细胞生长密度在60％-70％时，倒掉原有的10％FBS+DMEM/F12培养液，用PBS清洗两遍后， 加入等体积的2％的马血清的DMEM培养液，放入37℃温箱培养。细胞可每隔1至2天换液，显微镜 下观察细胞的生长形态状况，3-5天可观察到肌管形成，本试验选择诱导7天后的细胞进行试验。

(4)Fugene HP转染步骤

1)转染前12-24小时，取一瓶生长状况良好且细胞生长密度在80％左右的细胞，用胰蛋白酶消化 后，加入适量新鲜的不含任何抗生素的10％FBS细胞生长培养液，用吸管将细胞完全吹散并形成均匀的 细胞悬液，向24孔板中每孔加入500μL的细胞悬液，轻轻晃动培养板摇匀细胞后置于37℃，5％CO2 细胞培养箱中培养12h-24h；

2)转染时，孔板中的细胞生长密度应达到80％以上。取0.5μg质粒(pGL3-tnnc2-pro～pGL3-tnnc2-Q4) 加入50μL的OPTI-MEM溶液中，轻轻吹打混合均匀后再加入1.5μL的Fugene HP，室温静置25min；

3)弃掉孔板中的细胞培养液，用1×PBS或无血清无双抗培养液清洗细胞两次后，加入新鲜的细胞 培养液；

4)24孔板每孔加入(2)中混合液后，前后左右十字交叉的姿势晃动培养板混合均匀后，放入37 ℃，5％CO2细胞培养箱培养48h；

对于诱导分化后的C2C12细胞，待其在孔板中用2％HS培养液培养7天后，用Fugene HP转染。

实施例4：骨骼肌特异性表达基因tnnc2的启动子候选片段及相应缺失片段的双荧光酶活性的检测

本实施例设置阴性对照质粒pGL3-basic，阳性对照质粒pGL3-control，以海肾荧光素酶报告基因 pRL-TK(载体购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)做内参质粒(用以校 正转染效率)，转染细胞48h后收集细胞裂解液，利用双荧光素酶报告基因检测试系统对猪骨骼肌特异 性表达基因tnnc2的启动子不同缺失片段的活性及组织特异性进行分析，确定高活性并具备肌肉组织表 达特异性的区段。结果表明(见图5所示)：pGL3-tnnc2-pro、pGL3-tnnc2-Q1、pGL3-tnnc2-Q2、 pGL3-tnnc2-Q4在C2C12细胞中均存在不同程度的转录活性，在3T3-L1细胞中仅有pGL3-tnnc2-Q1存 在微弱的活性。在分化后的C2C12细胞中，pGL3-tnnc2-pro活性有极大的提高，而pGL3-tnnc2-Q1和 pGL3-tnnc2-Q2的活性减少，pGL3-tnnc2-Q4的活性降至与阴性对照一致。本发明最终获得2313bp的全 长启动子tnnc2-pro(序列信息见SEQ ID NO：1)和1048bp的tnnc2-Q2片段(序列信息见SEQ ID NO： 3)，两个片段具备独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。

实施例5：核心启动子驱动外源PPARγ基因在C2C12细胞中表达的验证

本实施例以tnnc2-Q2片段为研究对象，认为其是兼具肌肉特异性的核心启动子片段，连接与脂肪沉 积相关的PPARγ基因CDS区域，在核心启动子作用下，检测其在成肌细胞中的表达。

(1)以本实验室保存的pcDNA-3.1-PPARγ质粒为模板(见图5)，扩增猪PPARγCDS区域。为了增 强基因的表达，在上游引物5′端添加Kozak序列GCCACC，下游引物3′端添加6×his组蛋白标签序列 CACCACCATCACCATCAT及小鼠偏爱的终止密码子TGA，引物命名为①-tnnc2-Q2-PPARγ-F和① -PPARγ-6×his-R，引物序列见表4，PCR扩增参数同表2所示。

表4猪PPARγ基因克隆引物的设计

(2)限制性内切酶Hind III和Xba I双酶切pGL3-tnnc2-Q2后，采用PCR一步定向克隆 试剂盒将扩增的PPARγ的CDS区域连至tnnc2-Q2下游，体系如下：

PCR回收产物与pGL3-tnnc2-Q2回收产物37℃同源重组30分钟后，转化大肠杆菌DH5α，转化后 挑取阳性克隆送测。由于PPARγ片段上含有Hind III酶切位点，采用PCR方法代替双酶切鉴定重组质粒。 启动子特异性引物tnnc2-pro-F/tnnc2-Q2-R鉴定tnnc2-Q2片段，PPARγ-F/R鉴定PPARγ片段。引物 PPARγ-F/R分别为：5′ATGGGTGAAACTCT3′和5′GTACAAGTCCTTGTATATTTCCTGTAGG3′

(3)将构建好的质粒命名为pGL3-tnnc2-Q2-PPARγ，转染C2C12细胞，每个质粒做3个重复，同 时设置3个未转染任何质粒的C2C12细胞为空白对照。转染后48h，用OMEGA公司的RNA提取试剂 盒进行C2C12细胞的RNA提取(按试剂盒说明书进行操作)、进行反转录(按Thermo公司的反转录试 剂盒的说明书进行操作)，采用Roche公司的Light Cycler480荧光定量PCR仪(按仪器的说明书操作) 测定C2C12细胞中PPARγ的表达量，PPARγ及内参基因引物见表4，荧光定量PCR程序如表5所示：

表5扩增C2C12细胞cDNA的引物设计

表6荧光定量PCR扩增体系

定量试验的所有样品进行4次重复。基因相对表达量用2^-△△CT的算法，实验误差以SD表示，T检 验进行显著性分析。

结果表明，在转染了重组质粒pGL3-tnnc2-Q2-PPARγ的C2C12细胞中，PPARγ的表达量显著高于未 转染重组质粒的空白C2C12细胞，约3倍左右，证明肌肉特异性核心启动子tnnc2-Q2确实能够驱动外源 的PPARγ在小鼠的C2C12细胞中表达。