基于基因组重测序比较早实枳与普通枳遗传差异

摘要

早实枳为普通枳的早花变异。为研究早实枳起源及其与普通枳之间的遗传关系，本实验室前期曾采用过多种分子标记分析，也逐一克隆了主要成花调控基因的DNA序列，如FT、SOC1、FLC、TFL、PtmiR172、PtmiR156等，均未能发现早实枳与普通枳之间的区别。在柑橘属克里曼丁橘和甜橙全基因组测序数据发布后，本实验室对早实枳和普通枳进行了基因组重测序，以期发掘早实枳与普通枳的关键差异基因，为研究二者成花习性差异的分子机理寻找突破口。本研究通过生物信息学方法对基因组重测序结果中的InDel进行标记，按其插入缺失长短及是否造成移码进行了分级，试图筛选二者间关键的差异基因。采用RT-PCR验证差异基因后，构建超表达载体转化模式植物拟南芥验证差异基因的功能。主要研究结果如下:
　　1.以克里曼丁橘为参考基因组，采用生物信息学方法分析了早实枳和普通枳基因组重测序数据，发现二者与克里曼丁橘参考基因组之间存在较多的SNP与InDel差异，但与作为对照的克里曼丁橘×普通枳杂种相比，早实枳与普通枳中的SNP与InDel纯合位点百分率较高，暗示早实枳的起源可能是普通枳的珠心胚变异导致，而非异种间杂交产生。
　　2.分析InDel的分布情况，对大量InDel变异进行初筛，发现早实枳的CDS(Codingsequence)区域存在818个特异性InDel。采用PCR扩增、遗传转化、测序等方法验证28个早实枳和克里曼丁橘的InDel，共获得了10个(35.7％)InDel;而普通枳和克里曼丁橘的36个InDel中则有12个(30.0％)。表明重测序能够发现待测材料之间的遗传差异，但如果待测材料与参考基因组存在较大遗传差异时，检测分析到的变异位点存在一定误差。
　　3.对早实枳CDS区的818条特异片段进行筛选分类，依据其基因功能是否与成花相关、插入/缺失片段长短、插入/缺失片段长度是否为3的倍数，将其由重要性由低到高分别设定为1-5级。
　　4.对重要性判定为4和5的128条InDel进行验证，筛选得到6个在早实枳与普通枳的CDS区域含有InDel的差异基因，检测号分别为:Pt-Cc-009(ATSRG1)、Pt-Cc-034(NAD(P)-linked）、Pt-Cc-040(N2-dimethylguanosinetRNAmethyltransferase)、Pt-Cc-059(AGO5)、Pt-Cc-061（无注释）和Pt-Cc-062(zincfingerCCCH-typefamilyprotein)。
　　5.对Pt-Cc-061基因（UN基因）进行Realtime-PCR分析，发现其在早实枳的根、早实枳和普通枳的花中表达量较高。此外分别构建了早实枳和普通枳的UN基因的超表达载体，转化模式植物烟草和拟南芥，分别获得烟草转基因愈伤组织，和转基因拟南芥T1代种子。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 前人研究进展

1．2．1 遗传变异的形成机理

1．2．2 遗传变异的分析方法

1．2．3 基因组重测序在遗传变异分析中的应用

1．2．4 InDel标记的研究现状

1．3 本研究的内容及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株及质粒载体

2．1．3 试剂和仪器

2．1．4 培养基配方

2．2 试验方法

2．2．1 差异基因的筛选

2．2．2 超表达载体构建

2．2．3 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

2．2．4 根癌农杆菌介导的拟南芥遗传转化

2．2．5 荧光定量PCR

2．2．6 半定量RT-PCR

3 结果与分析

3．1 早实枳与普通枳全基因组重测序数据比较

3．1．1 早实枳与普通枳中InDel差异的数量分布

3．1．2 早实枳与普通枳中InDel差异的分布区域

3．1．3 转录组中InDel的比较分析

3．2 早实枳关键差异InDel基因的筛选

3．2．1 InDel差异数据可靠性分析

3．2．2 关键InDel差异基因的筛选

3．3 InDel差异基因的验证

3．4 差异基因表达模式验证

3．4．1 差异Pt-Cc-061基因氨基酸序列分析

3．4．2 差异基因时空表达

3．5 UN基因表达载体的构建

3．5．1 质粒载体和UN基因的酶切

3．5．2 含UN基因载体的农杆菌PCR阳性检测

3．6 农杆菌介导的烟草遗传转化

3．7 农杆菌介导的拟南芥遗传转化

4 讨论

4．1 早实枳和普通枳遗传背景差异

4．2 发育相关基因的发现

参考文献

附录

致谢