基因组重测序基础上的早实枳与普通枳部分差异基因比较分析

摘要

柑橘是世界范围内栽培最多的果树之一，其生长发育需要经过漫长的童期，极大地阻碍了柑橘早丰产的获取和遗传育种的研究。早实枳是普通枳的早花变异，两者之间除了开花习性不同外，其他特征几乎完全一样，前人的研究发现两者有相近的遗传背景，因此它也是研究柑橘成花发育的绝佳材料。本实验室对早实枳与普通枳进行了基因组重测序，参考克里曼丁橘全基因组数据库，通过生物信息学的方法对重测序数据进行了分析，得到了较多早实枳与普通枳存在差异的序列信息。本研究主要通过实验方法，采用PCR扩增和克隆测序对早实枳与普通枳之间的候选InDel进行验证，并对筛选出来的重点基因进行结构与功能分析。主要研究结果如下:
　　1.对存在于CDS区域的InDel进行分级。以克里曼丁橘基因组为参考，共设计引物97对，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、AT克隆测序的方法对InDel进行验证;
　　2.共有83对引物在PAGE胶中有清晰的条带。其中有12对显示早实枳与普通枳条带之间有差异，占总结果的14.5％，反映出基因组重测序及分析准确率较低;有40对显示早实枳与普通枳无差异，但与克里曼丁橘之间有差异，占总结果的48.2％，说明了枳与橘之间客观存在的遗传差异，可为它们之间开发分子标记提供借鉴;
　　3.通过AT克隆测序验证了12个早实枳与普通枳存在InDel的差异序列，基因编号为:Pt-21（未知基因）、Pt-35（PP2C型蛋白磷酸酶）、Pt-49(RHC2A型环指)、Pt-74（抗病蛋白）、Pt-75（抗病蛋白）、Pt-77（类RLP1受体基因）、Pt-81（甲基脂酶）、Pt-83（CCCH锌指家族）、Pt-84(NAD+，氧化还原酶)、Pt-86(MBD1，甲基化CpG结合域蛋白1)、Pt-87（未知基因）、Pt-88（未知基因）;
　　4.对3个重点差异基因进行表达分析。3个基因分别命名为PtAGO5、PtRZF和PtCCCHZF，以春梢和夏梢自剪前、中、后期顶芽为材料，进行RT-PCR实验。发现PtRZF和PtCCCHZF在春梢和夏梢的自剪前、中、后期表达量逐渐上升，且在早实枳与普通枳中表达模式类似，表明这两个基因可能参与了柑橘成花转变过程;PtAGO5基因在春梢中的表达模式与其他两个基因类似，但是在夏梢自剪过程中表现出了不一样的表达模式，可能与该基因的特异性功能有关;
　　5.对3个重点差异基因进行转基因功能验证。分别以早实枳和普通枳为模板构建了6个超表达载体，并转化烟草观察其表型差异。现已得到分别来自早实枳和普通枳的PtAGO5基因的转基因烟草T0代植株，但是目前尚未观察到两者之间有明显的表型差异。其他2个基因已获得转基因愈伤组织。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题的提出

1．2 全基因组测序

1．2．1 概述

1．2．2 全基因组测序在果树方面应用

1．3 全基因组重测序

1．3．1 概述

1．3．2 基因组重测序的应用

1．4 本研究内容与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株及质粒载体

2．1．3 试剂和仪器

2．1．4 烟草遗传转化培养基配方

2．2 实验方法

2．2．1 差异基因的验证

2．2．2 基因表达分析

2．2．3 超表达载体的构建

2．2．4 烟草的遗传转化

3 结果与分析

3．1 差异基因的筛选与验证

3．1．1 InDel分级

3．1．2 8％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

3．1．3 AT克隆测序分析

3．1．4 差异基因变异类型比较

3．2 差异基因序列分析

3．2．1 PtAG05基因序列分析

3．2．2 PtRZF序列分析

3．2．3 PfCCCHZF序列分析

3．3 差异基因表达分析

3．4 差异基因功能验证

3．4．1 超表达载体的构建

3．4．2 转基因及表型观察

4 讨论

4．1 重测序分析的准确性

4．2 发育相关差异基因的发掘

4．3 问题及展望

参考文献

附录

致谢