紫甘薯花色素与三种蛋白质相互作用的研究

摘要

小分子物质与蛋白质相互作用近年来被广泛的研究，这种研究不仅有助于阐释小分子的作用机理以及代谢动力学，还能确定小分子对蛋白质结构和生理特性的影响，避免发生不良反应。紫甘薯花色素（PSPA）作为一种天然色素型食品添加剂具有很大的开发价值和潜力。当 PSPA添加到食品中会与植物蛋白、酪蛋白等发生相互作用，食用到人体内会与消化道中的酶发生相互作用，然而 PSPA与蛋白质相互作用的研究未见报道，基础研究不足严重制约了PSPA的开发利用。本论文选取了消化道中两种重要的消化酶（胰蛋白酶和胃蛋白酶）和一种运输蛋白（牛血清蛋白），系统地展开了对PSPA与这三种蛋白质相互作用的深层次研究，以期为PSPA在食品、医药保健行业中更合理和更充分有效的利用提供理论依据。
　　主要研究结果：
　　（1）测定了PSPA与胰蛋白酶反应前后酶的催化活性、催化反应动力学并采用紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法和分子模拟法研究PSPA与胰蛋白酶相互作用特性。结果表明：PSPA对胰蛋白酶催化活性有较强抑制，并随作用时间的增加抑制率有小幅的增长，抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki=6.16×10-4mmol/L；PSPA与胰蛋白酶相互作用后使胰蛋白酶发生静态猝灭，室温下猝灭常数Kq为1.73×1012(mol/L)-1·S-1，结合常数KA为3.88×104 L·mol-1，结合位点数n为0.86；根据热力学参数得出花色素与胰蛋白酶的主要作用力为氢键和范德华力；据F?rster能量转移理论得出它们的结合距离为3.56nm；红外光谱经过去卷积、二阶导数处理得知与PSPA作用后胰蛋白酶的α-螺旋含量降低，β-折叠含量升高；分子模拟研究花色素与胰蛋白酶的结合部位，发现花色苷结合在胰蛋白酶活性位点附近。
　　（2）测定了 PSPA与胃蛋白酶反应前后酶的催化活性、催化反应动力学并采用紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法和分子模拟法研究PSPA与胃蛋白酶相互作用特性。结果表明：PSPA对胃蛋白酶催化活性有抑制作用，但随作用时间的增加抑制率没有太大变化，抑制类型为竞争性抑制，抑制常数Ki=7.35×10-2mmol/L；PSPA与胃蛋白酶相互作用后是胃蛋白酶发生静态猝灭，室温下猝灭常数Kq为1.86×1012(mol/L)-1·S-1，结合常数KA为1.64×104 L·mol-1，结合位点数n为0.78；热力学参数确定两者之间的作用力主要为疏水相互作用；据 F?rster能量转移理论得出它们的结合距离为3.15nm；红外光谱经过去卷积、二阶导数处理得知与PSPA作用后胃蛋白酶的α-螺旋含量降低，β-折叠含量升高；分子模拟研究花色素与胃蛋白酶的结合部位，发现花色苷结合在胃蛋白酶活性位点附近。
　　（3）PSPA与牛血清蛋白相互作用特性通过紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、圆二色谱和分子模拟法进行研究。结果表明：PSPA可使牛血清蛋白的内源荧光猝灭，猝灭类型为静态猝灭，室温下猝灭常数Kq为0.28×1012(mol/L)-1·S-1，结合常数KA为1.35×104 L·mol-1，结合位点数n为0.76；热力学参数确定两者之间的作用力主要为疏水相互作用；据 F?rster能量转移理论得出它们的结合距离为2.19nm；红外光谱经过去卷积、二阶导数处理得知与PSPA作用后牛血清蛋白的α-螺旋和β-折叠含量变化不明显；分子模拟研究花色素与牛血清蛋白的结合部位，发现花色苷结合在牛血清蛋白疏水腔内，疏水相互作用是其主要作用力。
　　（4）通过比较PSPA与三种蛋白质的相互作用特性可知：相同浓度的PSPA对胰蛋白酶抑制作用强于胃蛋白酶，且随着反应时间的延长PSPA对胰蛋白酶的抑制率变化大于胃蛋白酶；PSPA对胰蛋白酶的抑制常数小于胃蛋白酶进一步说明PSPA对胰蛋白酶抑制作用较强；PSPA使三种蛋白质都产生静态猝灭现象并发生非辐射能量转移，且与三种蛋白质的结合位点都为1；PSPA与牛血清蛋白的结合位点在色氨酸附近，而与胰蛋白酶和胃蛋白酶的结合位点都位于酶的活性中心附近，进一步证明PSPA对两种酶的抑制作用为竞争性抑制；比较结合常数和二级结构含量的变化可知，PSPA与胰蛋白酶的相互作用最强，胃蛋白酶次之，牛血清蛋白最弱；热力学参数研究发现 PSPA与胃蛋白酶和牛血清蛋白的主要作用力为疏水相互作用，而与胰蛋白酶的主要作用力为氢键和范德华力。

目录

声明

英文缩略语表

第一章 前言

1紫甘薯花色素结构及生理功能

1.1花色素结构

1.2 花色素生理功能研究现状

2三种蛋白质的结构与功能

3小分子物质与蛋白质相互作用的研究方法

3.1紫外可见光谱法

3.2荧光光谱法

3.3红外光谱法

3.4圆二色谱法

3.5分子模拟法

4本论文研究内容及意义

第二章 紫甘薯花色素与胰蛋白酶相互作用研究

1材料与方法

1.1实验材料和仪器设备

1.2方法

2结果与分析

2.1 PSPA对胰蛋白酶的抑制作用

2.2 PSPA作用胰蛋白酶后的紫外吸收光谱

2.3 PSPA作用胰蛋白酶后的荧光光谱

2.4 PSPA作用胰蛋白酶后的红外光谱

2.5 PSPA与胰蛋白酶分子模拟研究

3小 结

第三章 紫甘薯花色素与胃蛋白酶相互作用研究

1 材料与方法

1.1实验材料和仪器设备

1.2方法

2 结果与分析

2.1PSPA对胃蛋白酶的抑制作用

2.2 PSPA作用胃蛋白酶后的紫外吸收光谱

2.3 PSPA作用胃蛋白酶后的荧光光谱

2.4 PSPA作用胃蛋白酶后的红外光谱

2.5 PSPA与胃蛋白酶分子模拟研究

3小 结

第四章 紫甘薯花色素与牛血清蛋白相互作用研究

1 材料与方法

1.1实验材料和仪器设备

1.2方法

2 结果与分析

2.1 PSPA作用牛血清蛋白后的紫外吸收光谱

2.2 PSPA作用牛血清蛋白后的荧光光谱

2.3 PSPA作用牛血清蛋白后的红外光谱

2.4 PSPA与牛血清蛋白作用的圆二色谱

2.5 PSPA与牛血清蛋白分子模拟研究

3小 结

参考文献

致谢

附录