抑制素α基因RNAi片段转基因小鼠的干扰效果及其机理的初步研究

摘要

水牛是我国南方重要的地方品种，具有较强抗病及耐粗饲特性;水牛奶比荷斯坦奶牛的牛奶具有更高的蛋白率和乳脂率，在肉用和乳用等方面均具有很大的潜力，然而，水牛较低的繁殖性能制约着水牛业的发展。抑制素(Inhibin，INH)是重要的生殖激素，通过负反馈调节抑制促卵泡素(FSH，Follicle-stimulating hormone)的合成与分泌来抑制卵巢的发育和卵泡的成熟以及精子的发生与成熟，目前已经开展了通过研制INH单基因疫苗免疫提高猪、小鼠等动物繁殖力的研究。
　　为了通过持续干扰INHα基因来改善水牛的繁殖性能，本研究利用显微受精技术和转基因技术将水牛INHα基因RNAi片段（B和C）和小鼠INHα基因RNAi片段（M和C，其中片段C为针对水牛和小鼠中相同CDs序列设计的）分别整合到小鼠基因组中（公司协助），以该三个不同RNAi片段转基因阳性小鼠为研究材料，比较分析INHα基因三个不同RNAi片段的干扰作用及其效果，为研究INHα基因功能以及其在提高繁殖性能打下基础。本实验主要的结果如下:
　　1、INHα基因的三个不同RNAi片段的干扰作用及其效率的研究(1) INHα基因的RNAi片段干扰效率的分析:在F3代3周龄转基因雌鼠中，采用PCR技术检测其阳性;然后，利用QPCR技术分析该转基因阳性雌鼠的三个干扰片段的干扰效率，其干扰效率为C(96.1％)＞M(75.1％)＞B(27.5％)，可能是由于C片段是根据水牛和小鼠INHα基因共同CDs序列设计的且与干扰转录靶位点有关;
　　(2) INHα基因的RNAi片段阳性率的分析:提取F3代个体基因组DNA，用PCR分析后代转基因子鼠阳性比率，B、C和M片段在F3代中阳性率依次为81.3％、51.1％和77.6％，即阳性率B＞M＞C;
　　(3) INHα基因的RNAi片段对产仔性能作用的分析:统计和分析三个不同干扰片段转基因阳性小鼠连续三代第一胎产仔数，与野生小鼠相比，转基因小鼠后代的产仔数略有增加，B和M片段在F1、F2代第一胎产仔数有所增加，但没有显著差异（P＞0.05）。此外，比较三个不同干扰片段转基因阳性小鼠不同胎次产仔数，发现产仔数随胎次的增加有所下降，且低于野生型小鼠;
　　(4) INHα基因的RNAi片段对生殖激素、生殖腺重量影响的分析:ELISA方法检测F3代转基因小鼠血液中FSH、雌激素和雄激素的水平，结果表明这三种激素水平均有所上升。与野生型小鼠相比，3周龄F3代转基因小鼠的睾丸、卵巢及出生均重均显著增加（P＜0.05）;
　　2、携带B干扰片段转基因小鼠不同交配方式转基因后代干扰效果的比较分析:
　　根据试验结果，选择遗传稳定性较好、繁殖性能略高和生殖器官略重、根据水牛INHα基因序列设计的B干扰片段转基因小鼠，进行不同交配方式配种(B×B、B×WT，以野生型WT×WT为对照)。
　　(5) INHα基因的RNAi片段不同配种方式对INHα基因干扰效率影响分析:B×WT型小鼠的干扰效率低于携带B×B纯合小鼠后代，但干扰效率均达到70％以上，此外该杂交后代其阳性比率高于纯合后代;
　　(6) INHα基因的RNAi片段不同配种方式对小鼠成活、血液免疫相关指标影响的分析:转基因小鼠(B×B、B×WT)存活率高于野生型;血常规分析显示单核细胞数MO减少，淋巴细胞数LY增多，而红细胞数RBC显著增加（P＜0.05）;
　　(7) INHα基因的RNAi片段不同配种方式对睾丸支持细胞凋亡影响的分析:利用流式细胞仪检测技术分析了睾丸支持细胞的凋亡水平，转基因小鼠(B×B)睾丸支持细胞凋亡率(5.4％)显著高于野生型小鼠(1.46％)。QPCR检测相关凋亡因子P53和Bcl2，结果显示这两者mRNA水平均显著下调，但抗凋亡因子Bcl2表达水平下降的程度比促凋亡因子P53更高;
　　(8) INHα基因的RNAi片段不同配种方式对支持细胞相关基因表达影响的分析:支持细胞上骨桥蛋白OPN(Osteopontin)在转基因小鼠(B×B、B×WT)体内表达显著上升（P＜0.05）、FSH受体基因FSHR表达下降;细胞荧光实验表明二者均定位于支持细胞SC的细胞膜上，二者是否存在互作以及其功能还需进一步研究;
　　(9) IHNα基因干扰效率在20-70％范围内，可能有利于后代繁殖性状的提高;在70-80％范围内，可能对繁殖性能的影响不大;干扰效率超过80％可能会导致肿瘤的发生，不利于繁殖性能的提高。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述部分

1．1 前言

1．2 抑制素及抑制素基因研究进展

1．2．1 抑制素基因结构特征及其组织分布表达

1．2．2 抑制素基因的生理功能

1．2．3 抑制素在生产中的应用

1．3 转基因RNAi研究现状

1．3．1 RNAi的由来及其分子机制

1．3．2 RNAi分子机制作用模型

1．3．3 RNAi技术的应用及发展前景

2 研究目的和意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 实验转基因小鼠和细胞

3．1．2 主要试剂耗材及相关溶液配制

3．1．3 主要仪器设备

3．2 研究方法

3．2．1 RNAi片段转基因小鼠的检测

3．2．2 转基因RNAi对INH α基因抑制效果的检测

3．2．3 RNAi片段转基因小鼠血清中FSH、雌激素和雄激素水平测定

3．2．4 RNAi片段转基因小鼠血常规分析

3．2．5 RNAi片段转基因小鼠免疫荧光分析

3．2．6 干扰INH α对转基因小鼠相关基因表达的分析

4 结果与分析

4．1 INH α基因不同RNAi片段在转基因小鼠中干扰作用及其效率

4．1．1 RNAi片段对INH α基因表达干扰效果的分析

4．1．2 RNAi片段转基因小鼠阳性检测和遗传稳定性的分析

4．1．3 RNAi片段转基因小鼠繁殖性状及其生殖器官重量的分析

4．1．4 RNAi片段转基因小鼠血液中FSH、雌激素和雄激素水平的检测

4．1．5 RNAi片段转基因小鼠相关基因mRNA表达的探讨

4．2 比较分析INH α基因RNAi片段转基因小鼠不同交配方式的干扰效率

4．2．1 同交配方式转基因小鼠INH α基因表达的干扰效果的分析

4．2．2 不同交配方式转基因小鼠后代阳性检测及遗传稳定性的分析

4．2．3 不同交配方式转基因小鼠繁殖性状的分析

4．2．4 不同交配方式转基因小鼠存活率、雌性率的分析

4．2．5 不同交配方式转基因小鼠后代血常规的分析

4．2．6 不同交配方式转基因小鼠睾丸支持细胞凋亡的探讨

4．2．7 不同交配方式转基因小鼠相关基因mRNA表达的分析

5 讨论

5．1 不同RNAi片段转基因小鼠的干扰效率和遗传稳定性讨论

5．2 转基因小鼠不同RNAi片段的干扰效率对小鼠繁殖性能影响的讨论

5．3 转抗INH α基因发夹RNA小鼠中的相关基因及其功能的讨论

6 总结

6．1 本研究小结

6．2 本研究的创新点

6．3 本研究的不足之处与下一步计划

参考文献

在校期间发表的文章

致谢

附录