也木勒白羊卵泡抑制素α亚基DNA疫苗免疫原性及RNA干扰效果初步研究

摘要

抑制素(INH)又称卵泡抑制素或性腺抑制素，是一种主要由卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌产生的糖蛋白质激素，由一个α亚基和一个β亚基通过二硫键构成，其中抑制素α亚基（INHα）是抑制素发挥生理功能必不可少的。抑制素主要生理功能是抑制促卵泡素(FSH)的释放，对雌性动物主要表现为调节卵泡的生成，增加成熟的优势卵泡数量；对雄性动物主要表现为促进精子的发生，提高睾丸的生精能力；还对雌雄动物共同表现为促使性成熟提前。因此，可通过调节抑制素α亚基基因在机体内的表达量，降低体内抑制素水平，促进卵泡发育和精子的生成，最终提高动物的繁殖力。
　　目前主要通过两种途径降低动物体内抑制素的水平，其一是通过对动物进行主动或被动免疫抑制素原来使得机体内抑制素抗体含量增加，中和动物体内所分泌的抑制素，从而降低动物机体内的抑制素水平；其二是通过 RNA干扰技术下调抑制素α亚基基因 mRNA水平上的表达，最终致使动物机体内所分泌抑制素的量相对减少，降低在动物体内的抑制素水平。本研究运用了生物信息学技术、基因克隆技术、蛋白质分析技术、基因免疫技术等以新疆塔城地区也木勒白羊卵泡抑制素α亚基作为选择基因，对目的基因主要进行以下几方面的研究试验：
　　1、也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因的克隆及序列分析
　　为了克隆和序列分析也木勒白羊抑制素α亚基基因，根据 GenBank检索到的 INHα亚基基因序列(GenBank号：XM_004004955.1)设计一对特异性引物，本试验采集发情期也木勒白羊卵巢组织为研究对象，从中快速抽提总 RNA作为模板。利用基因克隆技术和现代生物技术对也木勒白羊 INHαcDNA进行克隆和测序及序列分析。测序及分析结果：也木勒白羊抑制素基因全长为1109bp，其中只含有1083bp组成开放阅读框(ORF)，其起始密码子为 ATG，终止密码子为 TAA，含完整的抑制素α亚基亚基序列编码区，共编码360个氨基酸残基。将所得序列提交到 GenBank，获得登录号：KP-113678。
　　2、也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因真核表达载体的构建
　　对也木勒白羊抑制素α亚基基因进行克隆和序列分析的基础上，采用定向克隆技术，构建也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因与绿色荧光蛋白基因融合表达载体 pEGFP- INHα，并对所构建的真核表达载体 pEGFP-INHα，运用菌液 PCR、双酶切、测序、BHK-21细胞瞬转及蛋白表达等试验进行鉴定。结果：本次试验成功构建了含也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因的绿色荧光真核表达载体(pEGFP-INHα)，并在 BHK-21细胞中获得了分泌型表达，转染率高达70％以上。检测到的该基因蛋白表达分子量约为40KD，该载体的构建为抑制素基因疫苗的研制奠定了一定基础。
　　3、也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因疫苗对家兔生殖激素的影响
　　为了初步研究构建的也木勒白羊卵泡抑制素α亚基绿色荧光真核表达载体（pEGFP-INHα）的免疫原性，在本实验中根据基因免疫技术，以成功制备的抑制素重组质粒 pEGFP-INHα为免疫原，对30只家兔进行基因免疫试验，应用酶联免疫法(ELISA)检测抗抑制素抗体，放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中部分生殖激素水平。结果：重组质粒 pEGFP-INHα免疫家兔后，各实验组抗体滴度均显著高于对照组(P<0.05)，且在第2次加强免疫后抗体水平明显上升。首次免疫后，促卵泡素(FSH)和雌二醇(E2)平均含量均高于对照组，且在第2次加强免疫阶段差异显著，但在两次免疫前后促黄体素（LH）均无明显变化。这些结果表明：抑制素基因免疫家兔可降低抑制素的含量，促进 FSH和 E2分泌，进而影响动物卵泡发育和诱导动物多产。
　　4、也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因靶向 SiRNA真核表达载体的构建
　　为了构建也木勒白羊抑制素α亚基基因靶向 SiRNA真核表达载体，根据本课题上传至 GenBank的 INHα基因序列（GenBank号：KP-113678.1）设计3个不同位点的干扰片段，利用 RNAi技术和实验室常规方法将3个干扰片段同时连接到同一个小 RNA专用真核表达载体中，并对其进行相关检测、鉴定及干扰效率评价。结果：干扰表达质粒能在绵羊颗粒细胞中成功表达，且转染率在60%左右，通过 Q-PCR和蛋白表达试验，发现试验组与对照组相比，试验组沉默效率达83%。

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缩略语表

引 言

第一章 文献综述

第一节 抑制素的研究

第二节 RNAi 的研究进展

第三节 也木勒白羊介绍

第四节 本研究的目的与意义

第二章 也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因克隆及序列分析

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因真核表达载体的构建

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因疫苗对家兔生殖激素的影响

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五章 也木勒白羊卵泡抑制素α亚基基因 SiRNA 真核表达载体的构建

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

作 者 简 介

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