一种生长抑制素超表达DNA疫苗及构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种生长抑制素超表达DNA疫苗及构建方法和应用，将质粒pEGS/2SS用XhoⅠ和EcoRⅠ两个内切酶进行消化，得到e含卡那霉素的两端有XhoⅠ和EcoRⅠ两个内切酶位点的pEGS/2SS片段，然后将合成好的tpa与pEGS/2SS片段连接反应，得到质粒pEGS/2SS-tpa。将质粒pEGS/2SS-tpa转化大肠杆菌感受态细胞DH5a中获得了大肠杆菌Escherichia coli DH5α(pEGS/2SS-tpa)，保藏编号：CCTCC NO :M2015105。将质粒pEGS/2SS-tpa作为DNA疫苗免疫小鼠，可促进小鼠生长、繁殖和泌乳，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及动物DNA疫苗的构建及应用，特别是涉及一种生长抑制素超表达DNA疫苗及构建方法和应用。

技术背景

生长抑素(Somatostatin,SS)基因疫苗，就是通过将编码生长抑素-14的基因克隆在真核表达载体上构建出的一个重组质粒。然后把该质粒导入动物体内，使SS-14在活体内表达出有活性的多肽，通过免疫应答产生抗生长抑素的抗体以达到中和内源生长抑素的目的，从而促进动物生长和泌乳。显然，在这种方法中发挥主要作用的是生长抑素。根据生长抑素“抑制垂体生长激素(growth hormone,GH)和催乳类激素释放”的作用，近年来国内关于SS基因免疫在动物繁殖方面的研究显示，SS基因免疫在促进动物生长和泌乳方面已初具成效，并取得较为明显的免疫效果。

众所周知，乳制品作为一种营养丰富、全面、消化吸收率高的优质液体食品，越来越受到广大消费者的喜爱，并受到普遍关注。鲜奶中含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸、维生素、矿物质和酶等，而奶类营养成分排序由高到低依此为水牛奶、羊奶、荷斯坦牛奶、人奶和马奶。这是因为，与普通牛奶相比，水牛奶的综合营养价值高出近2倍，酪蛋白含量高，胆固醇低，体细胞数低，干物质含量(17.5％)高0.5倍，不饱和脂肪酸含量高60-100倍，蛋白质含量(4％)高0.5倍，乳脂率7.5％，钙含量高0.3倍，锌含量高12倍，铁含量高78倍，维生素A含量高32倍(章纯熙2006)。因此，常饮水牛奶能促进更多的酪氨酸钙吸收，有助于骨骼和智力发育，降低心血管疾病发病率，提高人体免疫力。然而中国牛奶总产量仅占世界的6.4％，乳制品消费水平只是世界平均水平的1/5，同时水牛泌乳量、繁殖效率遗传力较低。上述现状的存在导致必然要对提高乳品质和泌乳性能展开研究。

生长抑素应用到动物泌乳是有例可循的。王艳玲等用SS的化学拮抗剂半胱胺(cysteamine hydrochloride,CSH)饲喂泌乳中期的荷斯坦奶牛，发现奶牛的日产奶量和饲料转化率都明显提高了(王艳玲等1999)。据Sun等报导，使用外源SS激素主动免疫泌乳母羊能显著提高其泌乳量(Sun et al.1990)。Imgap等在免疫大鼠时发现，只有主动免疫SS-14才能产生抗SS的抗体并且提高产奶量(Yiet al.1999)。肖慎华用“激生1号”(即一种SS重组痘苗病毒活载体疫苗)免疫奶牛，有促进泌乳的作用，并且使奶牛泌乳中后期的产奶量下降过程减慢，但乳品质未受影响(肖慎华2005)。以上研究结果表明，使用生长抑素基因疫苗来提高家畜的泌乳性能是可行的。

组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tpa)是一个特异的定位于内质网的信号肽，可将其偶联的蛋白直接转运到内质网，避免抗原被加工转运到胞质，目的蛋白以分泌形式在体内高量表达可保证理想的免疫原性的维持。tpa分子包含4个结构域，其一是F区，即N末端的47个残基，与调节纤连蛋白的纤维蛋白亲和力的手指结构域同源；其二是E区，与表皮生长因子同源；其三是K1和K2两个环状结构域；其四是P区，即丝氨酸蛋白酶区(Pennica et al.1983)。其中，F区和K2区的功能是与纤维蛋白结合，通过F区、E区和多糖链的调节下快速清除，而P区则发挥酶活性(Lijnen and Collen 1991)。随着提取和纯化过程的精确性提高，研究者发现tpa主要由内皮细胞释放，并且tpa 与血管纤溶酶原激活物(vascular plasminogen activator,vpa)、血液纤溶酶原激活物(blood plasminogen activator,bpa)具有免疫同源性，但却区别于尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,upa)(Rijken et al.1980)。通过进一步的生化研究表明，tpa是血纤蛋白溶解系统中的主要成分，生理性调控纤维蛋白溶解；

然而，tpa不仅是血纤蛋白溶解系统中的主要功能因子，其结构还决定了它是一个高效的信号肽。因此，tpa具备所有信号肽的共有作用，即首先被信号识别蛋白(signal recognition particle,SRP)识别，附着到ER膜上进行信号识别，将处于翻译状态的核糖体结合在RER膜上，待核糖体完成翻译后，经剪切修饰的成熟蛋白便会沿着导肽途径跨膜分泌到胞外。此外，作为信号肽，tpa不仅可以使其偶联蛋白变成分泌蛋白，而且便于在细胞中定位蛋白质和新生肽链(韦雪芳等2006)。目前，23bp的tpa信号肽已用作异源前导序列，被用作将目的蛋白带入细胞分泌途径的方法(Yang et al.2001,Costa et al.2006,Jalah et al.2007,Golden et al.2008,Luo et al.2008,Kaur et al.2009,Seo et al.2009)。随后，tpa的应用不只局限于细胞水平的研究，而是不断推广到其他领域，尤其是为构建防治动物疾病的基因疫苗方面开辟了新的途径。因为诱发基因疫苗产生高效且大量的免疫反应，取决于表达抗原的分泌能力(Watanabe et al.2003,Liang et al.2005)；而在基因疫苗中，tpa信号肽的存在可有效提高重组蛋白向胞外介质的分泌，并诱导机体对病原体产生很强的免疫反应(Li et al.1999,Alves et al.2000,Ashok and Rangarajan 2002)。Sinone M.Costa等将tpa与登革热病毒DENV-2的NS1全长基因进行融合，构建的疫苗pcTPANS1将重组的NS1蛋白以二聚体形式分泌到周围介质，攻毒后与对照组相比产生更高水平的NS-1特异性抗体，且以IgG1为主，趋向于Th2型反应(Costa et al.2006,Costa et al.2007,姚艳丰2012)。Yang等为提高戊型肝炎疫苗的抗体活性，比较了在戊型肝炎病毒HVE-p179N末端融合tpa信号肽和在HVE-p179C末端插入3个C3d补体重复序列这两种方式，发现免疫后产生的抗体中和抗原的水平均有提高，融合tpa的戊型肝炎疫苗产生抗体的时间提早2周(Yang et al.2010)。然而，关于tpa信号肽的应用并未止于单纯的复制沿用。Wang等将三聚体蛋白结构域引入质粒载体中时，发现tpa信号肽22位由脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，可提高目的蛋白的表达及分泌情况(Wang et al.2011)。除此之外，相关研究层出不穷，比如含tpa片段的甲型流感疫苗ptPAs/NP，肺结核DNA疫苗，联合电穿孔免疫的人乳头瘤病毒(papillomavirus,HPV)疫苗等等(Delogu et al.2002,Luo et al.2008,Seo et al.2009)。总之，当载体中的目的基因同tpa信号肽偶联后，不仅使目的基因表达分泌形式蛋白，而且可以增强体液免疫水平(Wang et al.2004,Costa et al.2006)。

泌乳是一个从乳腺组织分化到发挥作用的生理过程，主要涉及乳腺发育、泌乳发动与维持以及乳腺退化等环节，而每个阶段都是由激素参与调控的。哺乳动物乳腺发育是从胎儿时期开始的，此时的腺体和导管系统尚不发达，随着雌性动物个体发育，雌激素和孕激素水平提高，雌激素促进乳腺导管的生长，而孕激素刺激乳腺腺泡的发育(Lamote et al.2004)。并且雌激素刺激乳房基质细胞中IGFs的合成，从而促进乳腺上皮细胞生成(Tucker 2000)。此外，胎盘催乳素(Prolactin,PRL)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone,ACTH)、促甲状腺激素(thyrotropic hormone,TSH)等激素以及外界刺激均会影响乳腺细胞增殖。分娩时泌乳发动，此时的显著特征是催乳素和糖皮质激素的 分泌达到高峰。泌乳高峰期以异化分解为主，GH水平升高而胰岛素和甲状腺激素含量降低；此后同化合成为主(张少英1990)。但是，泌乳的启动与维持阶段主要受PRL和GH的调控。对反刍动物来说，GH和PRL共同影响泌乳量，GH影响乳脂合成，而PRL影响乳蛋白和乳糖的合成(Knight 2001)。皮质醇可维持上皮细胞的分泌活性，但未发现其促进乳汁生成的作用(Sjaastad et al.2010)。

据研究发现，不仅血浆中含有SS，乳汁中亦可检测到SS的存在。只是血浆中70％的SS是SS-28，而乳汁中仅有SS-14。这是因为在哺乳动物的乳腺组织中只表达PC-1蛋白酶基因，PC-1蛋白酶可促使促生长抑素原合成SS-14(Werner et al.1985,Holst et al.1990)。Chen et al.的研究指出，在大鼠的乳腺中可检测出的唯一一种神经肽就是SS，并推断SS可能参与泌乳活动，即乳腺的发育和发挥功能(Chen et al.1999)。此外，SS可在雌激素的协同作用下抑制PRL的分泌(Lee and Shin 1996)。

就反刍动物来讲，PRL是发动泌乳的必需因素。然而，泌乳一旦被发动起来，PRL便不再是决定泌乳量高低的限制因素了(张少英1990)。早在1940年，英国科学家便证实GH可能具有一定的催乳效应(Peel and Bauman 1987)。目前，用垂体或基因重组牛生长激素(bST)提高泌乳量的实践结果更证明了GH对泌乳维持的作用。韩正康等对每头泌乳牛每天注射12.5-50mg GH，结果发现注射后泌乳牛的乳产量一般可以提高15-24％，而其饲料利用效率可增长5-20％(韩正康1999)。其实，GH并非直接对乳腺产生影响，而是GH先刺激肝脏，使肝脏产生IGFs，而IGFs可以影响乳腺活动(苗树君1999)。也就是说，GH通过IGFs为媒介间接刺激乳腺细胞分化，增强乳腺的泌乳能力。GH具有协调乳腺和乳腺外组织对营养的竞争，使乳腺外组织的营养物质摄取量降低。在神经内分泌学方面的研究已经验证，GH被下丘脑和胃肠道释放的生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)和SS双重调控，即GH的分泌量由GHRH和SS这两种激素的共同作用所平衡。因此，一些研究通过调控促进GHRH分泌或抑制SS水平来提高体内GH的含量，从而达到提高泌乳量的效果(韩正康1999)。很多研究表明，使用GH注射泌乳牛的方法可以将泌乳量提高20-30％，经检验此方法并不会影响乳的成分或牛的健康状况(苗树君1999)。Machlin、Baird等研究人员分别通过注射提取的GH和DNA重组合成的GH至泌乳母牛体内，使泌乳母牛的泌乳性能都提高了10-25％(Machlin 1973,Baird and Durkin 1986)。1981年美国康奈尔大学用重组甲硫氨酰牛生长激素(MBS)对奶牛进行一个短期试验，结果表明在增加泌乳量这个方面，MBS与垂体衍生的GH的作用相当(Peeland Bauman 1987)。Chadio等用基因重组生产出的牛生长激素(bovine growth hormone,bST)处理泌乳期的山羊，发现除提高泌乳量外，还提高了乳脂和乳糖的含量，但乳蛋白的含量变化不大(Chadio et al.2000)。此外，Castigliego等对处于泌乳期的奶牛作用bST，检测到处理奶牛血浆中的bST和IGF-1水平均显著上升(Castigliego et al.2009)。如今美国已经将重组牛GH推广应用于乳业生产中，国内亦有类似的研究取得较好的成绩。比如陆东林等培养大肠杆菌，利用基因重组技术获取bST的粗提取物，以此处理奶牛一个月，每头牛泌乳量增加1.65kg/d(约10.75％)，但乳脂率、乳密度等指标未见差别(陆东林等1990)。尽管试验方法与检测指标各异，但总得来说GH可以促进哺乳动物的泌乳力。

从以上文献报道来看，tpa信号肽及生长抑素SS基因疫苗联合作用于动物泌乳和繁殖作用在国内外无相关报道，因此本发明对原有生长抑素基因疫苗pEGS/2SS进行了重组，构建了含tpa信号肽片 段的新型超表达生长抑素基因疫苗，意在提高该疫苗对动物免疫原性、泌乳和繁殖的作用，并探讨使用条件和免疫程序最优方案，为新型生长抑素基因疫苗在实际生产过程中的应用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有生长抑素基因免疫技术的缺陷，提供了一种超表达生长抑素的真核表达质粒pEGS/2SS-tpa，该质粒是将tpa片段插入质粒pEGS/2SS用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ获得。

本发明的另一个目的在于提供了一种包含有质粒pEGS/2SS-tpa的菌株；该菌株已于2015年3月12日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli DH5α(pEGS/2SS-tpa)，保藏编号：CCTCC NO:M2015105，该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到pEGS/2SS-tpa质粒。

本发明的最后一个目的是提供一种超表达生长抑素的真核表达质粒pEGS/2SS-tpa或包含其的大肠杆菌在制备生长抑制素DNA疫苗中的应用，将该DNA疫苗应用于小鼠，显著提高了小鼠生长、繁殖以及泌乳的功能。

本发明通过如下技术方案实施：

一种超表达生长抑素的真核表达质粒pEGS/2SS-tpa，通过以下方法制备得到

首先将质粒pEGS/2SS用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两个内切酶进行消化，得到含卡那霉素的两端有Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两个内切酶位点的pEGS/2SS片段，然后将合成好的tpa片段通过Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两个内切酶消化，得到有Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两个内切酶位点的tpa片段，将该基因片段与pEGS/2SS片段连接反应，得到质粒pEGS/2SS-tpa。

将质粒pEGS/2SS-tpa转化大肠杆菌感受态细胞DH5a中，得到以大肠杆菌为载体的超高效启动表达生长抑素DNA疫苗。该菌株已于2015年3月12日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli DH5α(pEGS/2SS-tpa)，保藏编号：CCTCC NO:M2015105，保藏地址：中国武汉武汉大学；该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到pEGS/2SS-tpa质粒。

大肠杆菌Escherichia coli DH5α(pEGS/2SS-tpa)为含有组织纤溶酶原激活物(tpa)的生长抑素真核表达质粒pEGS/2SS-tpa的混合培养物，通过SDS碱裂解法抽提即可得到pEGS/2SS-tpa质粒。培养基：1L LB固体培养基组成：10g氯化钠、5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、1.5g琼脂粉。培养条件：pH：6.8-7.8，温度：37℃，为Kan⁺抗性；在LB固体培养基中用平板划线法检测该培养物是否存活。

一种超表达生长抑素的真核表达质粒pEGS/2SS-tpa在制备生长抑制素DNA疫苗中的应用，将该质粒作为疫苗直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物。

在本发明中已经成功地应用于提高动物生长、繁殖及泌乳性能，如在小鼠中提高生长、繁殖以及泌乳的功能的应用。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、得到了一种高效启动生长抑制素的真核表达质粒载体pEGS/2SS-tpa；

2、得到了一种能够在小鼠的生长、繁殖和泌乳性能上显著效果的生长抑素DNA疫苗pEGS/2SS-tpa。在繁殖性能上有一定的优越性通过母鼠的窝仔数指标判定，其pEGS/2SS-tpa疫苗实验 组比pEGS/2SS生长抑素阳性对照组高多1只，比阴性组pEGFP-N1多达1.4只≈2只；通过断奶仔鼠的体重指标，可以得到pEGS/2SS-tpa组比pEGS/2SS生长抑素阳性对照组体重高10.7％，比阴性对照组pEGFP-N1高21.8％；且高效启动疫苗在高剂量组(200μg/只)、加免1次的增重、繁殖性能效果最佳。

附图说明

图1为真核表达质粒载体pEGS/2SS-tpa构建图谱。

图2为合成片段tpa的电泳鉴定图。

M为50bp DNA Ladder Marker；1-3泳道为待测的退火后的信号肽tpa经1％琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

图3为真核质粒载体pEGS/2SS酶切鉴定图谱。

M代表DL 2,000Marker；1泳道为真核质粒载体pEGS/2SS经限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的结果。

图4为真核质粒载体pEGS/2SS-tpa酶切鉴定图谱。

M代表DNA ladder；1泳道为质粒pEGS/2SS-tpa电泳结果，2泳道为质粒pEGS/2SS-tpa经限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的结果。

图5为不同质粒质粒转染MCF-7细胞GFP绿荧光的表达和分布情况。

其中图5中A为pEGFP-N1、pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa三种质粒转染MCF7细胞24h后观察GFP绿荧光的表达情况。Bright和fluorescence分别是在明场和荧光场下的观察结果，标尺代表200μm。

图5中B为pEGFP-N1、pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa三种质粒转染MCF7细胞48h后观察GFP绿荧光的表达情况。Bright和fluoresce分别是在明场和荧光场下的观察结果；标尺代表200μm。

图5中C为pEGFP-N1、pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa三种质粒转染MCF7细胞24h后观察GFP绿荧光的分布情况；标尺代表200μm。

图6为实时荧光定量PCR法真核质粒转染MCF-7细胞后SS的超表达效果比对图。

pEGFP-N1、pEGS/2SS或pEGS/2SS-tpa分别转染MCF-7细胞后48h，检测细胞中生长抑素SS的表达情况。SS的表达量以GAPDH的表达量进行标准化，表达倍数是相对于SS在pEGFP-N1转染组的表达来计算的，最终以均值标准误表示，每个数据有3个生物学样品为重复。**P<0.01

图7为真核质粒pEGS/2SS-tpa转染MCF-7细胞后蛋白表达结果。

MCF-7细胞转染pEGFP-N1、pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa后利用Western Blot检测生长抑素SS-14蛋白的表达情况；同时选取GAPDH蛋白的表达量进行标准化校正，表达倍数是相对于pEGFP-N1来计算的。

图8为Trizol法提取昆明小鼠组织RNA，RNA浓度的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

M为DNA ladder，泳道1-10依次是昆明小鼠的心脏、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠、胃、脑和胰腺组织RNA。

图9为昆明小鼠各组织中生长抑素SS表达量检测结果。

泳道1-9依次是心脏、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠、胃、脑的组织RNA扩增生长抑素的结果。

图9中A为免疫pEGS/2SS-tpa后5d的昆明小鼠体内SS分布情况；

图9中B为免疫pEGS/2SS后5d的小鼠体内SS分布情况。

图10为疫苗免疫昆明小鼠后生长激素GH的分泌水平结果。

与空载注射组pEGFPN1相比，免疫pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa后小鼠GH的分泌量均有所提升，但是肌肉注射pEGS/2SS后小鼠GH提高并不显著，而注射pEGS/2SS-tpa后小鼠GH含量显著高于注射pEGS/2SS的小鼠(P<0.05)。说明生长抑素基因疫苗pEGS/2SS免疫后可以增加GH的释放，插入tpa信号肽后这种作用更加明显。

图11为疫苗免疫昆明小鼠后催乳素PRL的分泌水平结果。

与空载免疫组相比，pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa免疫组的小鼠PRL含量均有提高；并且肌肉注射pEGS/2SS-tpa后小鼠PRL含量与注射pEGS/2SS的小鼠相比显著升高(P<0.05)，与对照组小鼠相比差异极显著(P<0.01)。说明通过生长抑素基因免疫后可以增加小鼠PRL的分泌，并且在插入tpa信号肽后这种促进作用尤其明显。

图12为疫苗免疫昆明小鼠后生长抑素SS的分泌水平结果。

与空载注射组相比，免疫pEGS/2SS后小鼠SS的分泌量有所下降，但下降不显著；免疫pEGS/2SS-tpa后小鼠SS含量反而高于对照组的小鼠，虽然差异亦不显著。说明生长抑素基因疫苗pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa免疫后，不会对小鼠血液中的SS造成显著影响。

具体实施方式

实施例1：

真核表达质粒载体pEGS/2SS-tpa的构建

1、组织纤溶酶原激活物(tpa)基因克隆及序列分析

根据已在GenBank(ID:5327)plasminogen activator,tissue[Homo sapiens(human)]基因序列，合成plasminogen activator,tissue(tpa)的cDNA序列其两端的酶切位点为Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ,采用Primer5.0引物设计软件，tpa序列设计如下：(方框内为tpa序列，两端为酶切位点)

tpa-F：

5-TCGAGG-3

tpa-R：

3-CCTTAA-3，生工生物工程(上海)股份有限公司通过碱基合成h获得tpa基因片段。

序列合成后，将上下游片段稀释至每OD加140μL ddH₂O，配成10μM贮存液，然后将两条单链退火形成双链。退火体系为10μL tpa-F与10μL tpa-R混合，退火条件为95℃30s、72℃2min、37℃2min、25℃2min。退火后琼脂糖凝胶电泳检测，观察电泳条带与目的条带大小相符，于4℃储存备用。(图2)

2、载体pEGS/2SS的酶切与回收 

用限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pEGS/2SS质粒(曹少先,杨利国,张文伟,等.生长抑素基因疫苗质粒pEGS/2SS的构建及表达[J].中国兽医学报,2005,25(5):499-502.)，切除16bp，露出两端的粘性末端，酶切体系如下：

酶切后经1％琼脂糖回收胶电泳分离出质粒条带，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行质粒大片段回收，回收后电泳检测，观察电泳条带与目的条带大小相符。(附图3)

3、目的基因连接

分别测定回收的pEGS/2SS质粒酶切片段和稀释10倍的tpa片段的浓度，计算出载体与目的片段的连接体积比为6:1，根据Invitrogen T4 DNA Ligase说明书连接pEGS/2SS载体和目的基因tpa片段，16℃过夜，连接体系如下：

4、重组质粒转化感受态细菌

1)感受态细菌DH5α(天根生化科技(北京)有限公司生产)

2)将大肠杆菌感受态细胞DH5α从-80℃中取出冰浴解冻，加10μL连接产物入50μL感受态细胞中混匀，并设置未加连接产物的感受态细胞作为空白对照，冰浴30min；转至42℃热激90s，然后迅速冰浴5min；加入400μL LB液体培养基，摇床调至200r/min、37℃振荡培养1h；轻轻混匀后吸取100μL，使用涂布器均匀涂于含Kan的LB固体平板上，37℃培养12h后，观察是否有转化菌落长出。

5、pEGS/2SS-tpa质粒的筛选与鉴定

挑取单菌落在含Kan的LB液体培养基中振荡扩大培养8h，使用试剂盒进行质粒小提，经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切应切出tpa(75bp)。酶切体系如下：

取5μL酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察电泳条带与目的条带大小相符，送到生工生物工程(上海)有限公司测序，分析测序结果，质粒pEGS/2SS-tpa测序结果100％比对成功。鉴定正确的pEGS/2SS-tpa质粒-20℃保存备用，将质粒pEGS/2SS-tpa转化大肠杆菌感受态细胞DH5a中，得到以大肠杆菌为载体的超高效启动表达生长抑素DNA疫苗。该菌株已于2015年3月12日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli DH5α(pEGS/2SS-tpa)，保藏编号：CCTCC NO:M2015105，该菌株通过SDS碱裂解法抽提即可得到pEGS/2SS-tpa质粒。含pEGS/2SS-tpa质粒的菌液保种，-80℃保存。(图4)

实施例2：

生长抑素超表达质粒pEGS/2SS-tpa质粒在体外蛋白表达的检测

1、抑制素重组质粒pEGS/2SS-tpa转染细胞

用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提大肠杆菌Escherichia coli DH5α(pEGS/2SS-tpa)质粒，待MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)单层长至60％-70％时按Lipofectamine^TM2000脂质体转染试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书进行操作，按照每孔加0.2μg质粒和1.5μL Lipofectamine^TM2000计算，分别用无血清培养基OPTI-MEM溶解混匀，室温静置5min。然后将配置好的质粒和脂质体溶液等体积混合，室温静置20min。期间吸除细胞培养板中的培养基，PBS清洗2-3遍，加OPTI-MEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中孵育处理。20min后取出24孔板，吸除OPTI-MEM培养基，每孔加100μL OPTI-MEM培养基，并缓慢滴加100μL质粒-脂质体复合物。细胞处理设置分别为：pEGFP-N1转染组，pEGS/2SS转染组、pEGS/2SS-tpa转染组以及空白对照组，每组分别设置3个平行重复。37℃、5％CO₂培养箱中培养5-6h后，换成DMEM完全培养液(即DMEM+15％FBS)继续培养。

2、抑制素重组质粒pEGS/2SS-tpa转染细胞绿色荧光蛋白表达

在转染24h和48h后分别在荧光显微镜下观察不同处理组的细胞生长状态和绿色荧光，通过对比细胞白场和绿色荧光强度判断MCF-7细胞的转染效率，间接确定载体目的蛋白最佳表达时间。

当MCF-7细胞80％汇合时分别转染pEGFP-N1、pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa，转染24h和48h后，在荧光倒置显微镜下，蓝光激发后观察视野里的绿荧光。可以看到试验组均有绿色荧光呈现，而转染48h后的绿色荧光信号强度明显高于转染24h后的信号强度。因此，以下细胞试验均采用转染后48h的细胞(图5)。

pEGFP-N1和pEGS/2SS转染组细胞的绿色荧光在MCF-7细胞中呈均匀连续分布，pEGS/2SS-tpa转染组细胞的绿色荧光呈散点状分布于细胞。说明插入信号肽tpa片段改变了目的蛋白在细胞中的表达分布，使目的蛋白被转入到内质网中进而分泌到细胞外。(图5C)

3、超表达生长抑素质粒pEGS/2SS-tpa体外表达的检测

3.1 Western Blot检测目的蛋白的表达情况

细胞蛋白的提取：取细胞裂解液RIPA，融化后颠倒混匀数次(若有沉淀可置37℃溶解)，分装，与蛋白抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF，100mM)按比例混匀，使终浓度为1mM，现配现用。转染后的MCF-7细胞弃培养液，4℃预冷的PBS清洗2-3遍。加适量裂解液，吹打细胞充分裂解。10,000rpm离心3-5min，取上清，分装，-80℃保存备用。以上所有操作均在冰上操作。

蛋白浓度的测定：根据BCA蛋白浓度测定试剂盒确定标准曲线及样品蛋白浓度。具体步骤如下：

(1)取0.8mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解，配成25mg/mL的蛋白标准液，配制后立即使用；

(2)取适量25mg/mL的蛋白标准液，稀释至终浓度0.5mg/mL；

(3)根据样品数，按50倍体积BCA试剂A加1倍体积BCA试剂B(即A:B＝50:1)配适量BCA工作液，充分混匀；

(4)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔酶标板中，用标准品稀释液(即PBS)补足至20μL，即浓度分别为0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg/mL，作为标准孔；

(5)加等体积样品至96孔酶标板的样品孔中，稀释至20μL；

(6)各孔加200μL BCA工作液，37℃温浴30min；酶标仪测定562nm(540-595nm之间均可)波长下吸光值；

(7)制作标准曲线，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。

SDS-PAGE电泳：根据目的蛋白的分子量大小55KDa，配置15％的分离胶，5％的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳。制备分离胶时为防止漏胶，可用少量低浓度琼脂糖胶封底，再注入分离胶至白板，然后用水压平分离胶液面，凝固约30min；浓缩胶在插入梳子后加满，凝固1-2h。将制胶板放入电泳槽，加电泳缓冲液1×Tris-Gly约400mL。上样前蛋白与Loading Buffer混合后沸水浴5min，使蛋白变性。每孔的蛋白上样量50μg，冰浴电泳，先用恒压80V电泳约20min至浓缩胶和分离胶界面处，再换成恒压120V继续电泳约50min，使样跑到胶底部，停止电泳，取出玻璃板。

转膜：用尺子量取胶的长宽，剪取相应大小的滤纸6张，浸泡在转膜缓冲液中。根据Marker条带衡量目的融合蛋白S/2SS-GFP(55KDa)和内参蛋白GAPDH(37KDa)的大致位置，剪取相应大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡3-5min除气泡。蒸馏水浸湿石墨板，平放打开，由下至上依次铺放负极板、3层滤纸、PVDF膜、3层滤纸和正极板，每铺一层用试管赶气泡，盖紧电极板。冰浴电转，250mA电流转膜约45min。转膜结束后，取胶放入染料中染色，检查是否转膜完全。

封闭：使用TBST配1％BSA封闭，室温水平摇床1h。

一抗孵育：TBST洗膜3次，每次10min；用0.1％BSA稀释Somatostatin一抗(1:300稀释，Santa Cruz)及内参GAPDH抗体(1:1000稀释，Boster)，封膜，4℃孵育过夜。

二抗孵育：TBST洗膜3次，每次10min；用0.1％BSA稀释羊抗兔IgG-HRP(1:1000稀释，Boster)室温孵育1h。

显色：TBST洗膜3次，每次10min；最后加入显色液显色3-5min，显影并扫描，曝光时间600s；用AlphaEaseFC软件计算光密度，通过与内参蛋白GAPDH的比较，推算出蛋白的相对表达量。

不同质粒转染MCF-7细胞48h后提细胞蛋白，Western Blot检测生长抑素SS-14的相对表达情况，结果显示与空白对照(monk)相比，pEGS/2SS转染组与pEGS/2SS-tpa转染组在55KDa处均有条带，并且与目的蛋白的大小一致；依据颜色推测，MCF-7细胞转染pEGS/2SS-tpa质粒后SS的表达量略高于转染pEGS/2SS质粒后SS的表达量。(图6)

实施例3：

本发明生长抑素超表达DNA疫苗在昆明鼠上对其生长以及免疫应答的影响

1、疫苗制备： 

将经鉴定正确的pEGFP-N1、pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa菌液加入至250mL含Kan的LB液体培养基中扩大培养，200r/min、37℃、12h。使用质粒去内毒素大提试剂盒大量提取质粒，测质粒浓度，酶切及测序验证。根据需要，质粒用生理盐水稀释至不同浓度，分装后-20℃储存备用。

2、试验动物免疫试验：

100只雌性3周龄昆明鼠随机分为10组(称重保证各实验组的初始体重无显著差异)，10只/组，室内温度一直保持在28度左右。试验期期内动物房一直保持清洁、卫生，及时清除舍内粪尿，保持舍内干燥。用“正交设计助手II 3.1软件”设计3因素(疫苗、免疫剂量、免疫次数)、3水平(pEGFP-N1、pEGS/2SS、pEGS/2SS-tpa；低、中、高；2次、3次、4次)的正交试验。试验分组如下：

表2小鼠免疫试验分组

根据分组对小鼠进行免疫，采取小鼠股四头肌多点注射，首次免疫后间隔2w加强免疫，免疫后连续一周观察小鼠的精神和身体状况。小鼠按常规标准饲养，每周换垫料2次，自由采食和饮水。

3.小鼠称重

在首次免疫前对小鼠称重，初免后2w、4w、6w、8w对小鼠进行称重，并记录体重数据，直至试验结束。

初免前、初免后2w、4w、6w、8w对试验小鼠进行称重，记录体重变化规律，发现小鼠从3周 龄到5周龄(即初次免疫后2周内)的生长最快，之后增重逐渐减缓，这和昆明鼠生长发育期的增重规律一致(景志忠等1996)。分别对疫苗、剂量和加免次数做单因素方差分析，显示不同疫苗免疫对母鼠增重有影响，而不同剂量组和不同加免次数组的体重差异均不明显。其中对不同疫苗的单因素方差分析如表3所示，可以明显看出pEGS/2SS免疫组、pEGS/2SS-tpa免疫组和对照组小鼠的初始重基本一致，初免后4w(即第二次加强免疫前)pEGS/2SS免疫组和pEGS/2SS-tpa免疫组的母鼠增重较之对照组均有显著差异，但pEGS/2SS-tpa免疫组的母鼠增重与pEGS/2SS免疫组相比无明显差别，尽管pEGS/2SS-tpa免疫组的增重略高于pEGS/2SS免疫组；初免后4-8周母鼠生长速度减缓，可见pEGS/2SS-tpa免疫组的母鼠增重数值虽无显著差异性，但是在数值上仍略高于pEGS/2SS免疫组和对照组；

由初免时起至最终免疫后2w止，不同疫苗组的母鼠生长期总增重有所差异，即pEGS/2SS-tpa免疫组和pEGS/2SS免疫组的母鼠增重均显著高于对照组，但pEGS/2SS-tpa免疫组与pEGS/2SS免疫组之间差异不显著。用小鼠生长期的体增重衡量小鼠的生长性状，说明疫苗pEGS/2SS-tpa和pEGS/2SS均可提高雌鼠的生长速率，且疫苗pEGS/2SS-tpa对雌鼠的生长促进作用略优于疫苗pEGS/2SS。

表3不同疫苗免疫对母鼠增重的影响

注：同一列中任意两个数字的后置字母相同视为差异不显著P>0.05，反之则视为差异不显著P<0.05。

4.免疫对小鼠繁殖性状的影响

4.1小鼠产仔数和仔鼠增重

最后一次免疫2w后(即小鼠11周龄时)每笼投放一只公鼠，合笼，次日观察母鼠阴道栓，检查是否成功配种。此后21d内注意母鼠的妊娠状况，详细记录母鼠妊娠周期、产仔数以及仔鼠初生重和断奶重(即仔鼠3周龄)。

在母鼠11周龄时配种，妊娠期20-23d，记录母鼠窝产仔数，不同疫苗处理组之间母鼠产仔数差异不显著(表4)。但我们还是可以看出在小鼠的个数上体现了优越性，其pEGS/2SS-tpa疫苗实验组比pEGS/2SS生长抑素阳性对照组高多1只，比阴性组pEGFP-N1多达1.4只≈2只。说明pEGS/2SS-tpa疫苗在母鼠的繁殖性能上仍然具有一定的优越性。

表4不同免疫方式母鼠的产仔情况

注：同一列中任意两个数字的后置字母相同视为P>0.05，反之则视为P<0.05。

记录仔鼠哺乳期间窝增重，哺乳期21d，用仔鼠哺乳期间窝增重衡量母鼠的泌乳性状。纵观不同处理组的仔鼠窝增重，pEGFP-N1注射组与空白对照组的窝增重无明显差异，其余处理组组间仔鼠窝增重有显著差异。然后分别对疫苗、免疫剂量和加免次数3个因素进行单因素分析：不同疫苗对仔鼠断奶重的单因素方差分析(表4(a))显示，免疫pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa后断奶重显著增加，且免疫pEGS/2SS-tpa后的断奶重显著高于pEGS/2SS免疫组，说明免疫pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa后确实可促进母鼠的泌乳性能，其中pEGS/2SS-tpa的促泌乳效果更好；不同剂量对仔鼠断奶重的单因素方差分析(表4(b))显示，高剂量免疫的断奶重高于中剂量免疫但差异不显著，高剂量、中剂量均与低剂量有显著差异，说明高剂量(200μg)免疫可显著促进泌乳；不同加免次数对仔鼠断奶重的单因素方差分析(表4(c))显示，加免1次与加免2次的断奶重差异不显著，但均显著高于加免3次，说明加免1次的促泌乳效果较好。总之，不同疫苗、免疫次数及免疫剂量均对仔鼠断奶重产生显著影响，考虑到仔鼠断奶重主要受母鼠泌乳能力的影响；采用高剂量(200μg)免疫2次pEGS/2SS-tpa对雌鼠泌乳的促进效果最佳。

表4(a)不同疫苗免疫对仔鼠断奶重的影响

表4(b)免疫剂量对仔鼠断奶重的影响

表4(c)免疫次数对仔鼠断奶重的影响

注：同一列中任意两个数字的后置字母相同视为差异不显著P>0.05，反之则视为差异不显著P<0.05。

5、RT-PCR检测目的基因的转录检测

5.1组织总RNA提取

免疫5d后每组随机选取1只小鼠采集心脏、肝、脾、肺、肾、注射部位肌肉、小肠、胃、大脑、胰腺，用Trizol法提取组织RNA，详细步骤如下：

(1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次；

(2)匀浆：组织样品按50-100mg/mL Trizol加入Trizol，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2min；

(3)组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；

(4)12,000rpm离心5min，弃沉淀； 

(5)按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；

(6)4℃12,000g离心15min；

(7)吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；

(8)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

(9)按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(10)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清；

(11)室温晾干或真空干燥5-10min；

(12)用50μL DEPC H₂O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min；

(13)测OD值定量RNA浓度，A260/A280值应1.6-1.8之间，并作琼脂糖凝胶电泳检验是否降解。

初次免疫5d后每组随机选取1只小鼠采集各组织，用Trizol法提取组织RNA，RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图如图所示，28S、18S和5S三条带均清晰可见，其中脑组织的RNA有降解趋势；浓度在300-1000ng/μL不等，OD₂₆₀/OD₂₈₀值均介于1.8～2.0之间，说明提取的组织总RNA纯度较好，可用于后续试验。(图8)

5.2反转录(方法参照实施例2中反转录方法步骤)

5.3目的基因SS的扩增

将反转录的cDNA作5倍稀释后，PCR扩增内源SS(引物设计见表5)。

表5细胞中生长抑素引物设计

PCR扩增体系如下：

反应条件为95℃预变性3min、95℃变性30s、60℃退火30、72℃延伸15s，扩增35个循环后，72℃5min、15℃2min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，验证生长抑素是否已在小鼠体内正常转录。

提取的各组织RNA经反转录得到cDNA，再分别以各组织cDNA为模板扩增生长抑素，发现除了内源生长抑素正常分布的中枢神经系统(如脑等)和消化系统(如胃、肠等)的各组织以外，在心脏、肺、肾脏和注射部位肌肉等组织中也出现微弱条带。说明在注射生长抑素基因疫苗后，质粒中的生长抑素片段可在小鼠的各组织器官转录。(图9)

6.小鼠血液和组织采集

6.1小鼠血液采集 

分别于免疫前和试验结束后，用断尾采血法采集小鼠血液，收集于有20μL EDTA抗凝剂/管的1.5mL EP管中，3,000r/min离心10min，小心吸取上层血浆，分装约200μL/管，置于-20℃保存备用。

6.2小鼠组织采集 

试验结束后脊椎处死小鼠，每组解剖采集部分小鼠的心脏、肝、脾、肺、肾、注射部位肌肉、小肠、胃、大脑、卵巢(卵巢称重)，置于4％多聚甲醛固定液中，另一部分小鼠的各组织器官采集后收集在离心管中，-80℃保存。

7.相关激素和抗体检测

7.1生长激素、催乳素和生长抑素的检测

用双抗体一步夹心ELISA法检测不同处理的小鼠血浆中激素GH、PRL与SS的含量，具体步骤如下：

(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；

(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(3)样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加；

(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min；

(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；

(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

(7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；

(8)绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中GH、PRL和SS的浓度(计算值乘以5为最终浓度值)。

7.1.1生长激素的分泌水平

双抗体夹心ELISA检测GH的标准曲线公式为：Y＝-0.30+8.94X-14.86X²+18.49X³-6.08X⁴，其中Y为GH浓度(ng/mL)，X为450nm处OD值(见附录)。将测得的OD₄₅₀值代入此标准曲线公式中，计算得到小鼠血浆中的GH浓度。对不同处理组与对照组两两之间做T检验分析，有差异。因此，分别对疫苗、免疫剂量和加免次数3个因素进行单因素分析，发现不同免疫剂量和免疫次数对GH的浓度没有显著影响，但不同疫苗免疫后小鼠血液中GH含量差异显著，与空载注射组相比，免疫pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa后小鼠GH的分泌量均有所提升，但是肌肉注射pEGS/2SS后小鼠GH提高并不显著，而注射pEGS/2SS-tpa后小鼠GH含量显著高于注射pEGS/2SS的小鼠(P<0.05)。说明生长抑素基因疫苗pEGS/2SS免疫后可以增加GH的释放，插入tpa信号肽后这种作用更加明显，虽然并未在小鼠的生长性状上表现出来。(图10)

7.1.2催乳素的分泌水平

双抗体夹心ELISA检测PRL的标准曲线公式为：Y＝-1.20+22.96X-30.46X²+70.88X³-32.56X⁴，其中Y为PRL浓度(ng/mL)，X为450nm处OD值(见附录)。将测得的OD₄₅₀值代入此标准曲线公式中，得出的小鼠血浆中的PRL浓度，做两两组间的T检验分析，显示不同组间的PRL浓度有差异。因此，对疫苗、免疫剂量和加免次数3个因素分别进行单因素分析，发现不同免疫剂量和免疫次数对PRL浓度的影响不显著，但免疫不同疫苗后小鼠血液中PRL的含量有显著性差异，与空载免疫组相比，pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa免疫组的小鼠PRL含量均有提高；并且肌肉注射pEGS/2SS-tpa后小鼠PRL含量与注射pEGS/2SS的小鼠相比显著升高(P<0.05)，与对照组小鼠相比差异极显著(P<0.01)。说明通过生长抑素基因免疫后可以增加小鼠PRL的分泌，并且在插入tpa信号肽后这种促进作用尤其明显，这个结果与母鼠泌乳性状结果相对应，并可充分解释免疫后母鼠泌乳能力提高的现象。(图11)

7.1.3生长抑素的分泌水平

双抗体夹心ELISA检测SS的标准曲线公式为：Y＝-1.31+32.39X-56.62X²+86.87X³-32.52X⁴，其中Y为SS浓度(pg/mL)，X为450nm处OD值(见附录)。将样品的450nm处OD值代入到上述标准曲线公式中，计算出小鼠血浆中SS的浓度。对不同处理组与对照组两两做T检验分析，发现不同组间小鼠血液中SS含量无明显差异。进一步对疫苗、免疫剂量和加免次数3个因素单独进行单因素分析，发现不同疫苗、不同免疫剂量和不同免疫次数均未对SS的浓度产生显著影响。不同疫苗免疫对小鼠血液中SS含量的影响结果，与空载注射组相比，免疫pEGS/2SS后小鼠SS的分泌量有所下降，但下降不显著；免疫pEGS/2SS-tpa后小鼠SS含量反而高于对照组的小鼠，虽然差异亦不显著。说明生长抑素基因疫苗pEGS/2SS和pEGS/2SS-tpa免疫后，不会对小鼠血液中的SS造成显著影响。(图12)

7.2生长抑素抗体的检测

用间接ELISA方法检测免疫后小鼠体内SS抗体的生成情况，具体步骤如下：

(1)96孔酶标板每孔包被标准生长抑素抗原(Sigma-Aldrich，S9129)100ng/100μL，4℃孵育过夜；

(2)弃反应液，PBST洗涤5次，300μL/孔，每次1min；

(3)加封闭液(即1％BSA溶液)200μL/孔，37℃孵育1h；

(4)弃反应液，PBST洗涤5次，300μL/孔，每次1min；

(5)加待测血浆(1:200稀释)100μL/孔，同时设置阴性对照孔、非特异性吸附孔(即PBST代替血浆)以及调零孔，37℃孵育1h；

(6)弃反应液，PBST洗涤5次，300μL/孔，每次1min；

(7)加羊抗鼠IgG-HRP(Boster，BA1050，1:2000稀释)100μL/孔，37℃反应1h；

(8)弃反应液，PBST洗涤5次，300μL/孔，每次1min；

(9)加TMB底物显色液150μL/孔，避光反应25min；

(10)加2mol/L H₂SO₄终止液50μL/孔终止反应，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。

根据SS抗体标准品的浓度与OD₄₅₀值绘制标准曲线，将样品的所测OD₄₅₀值代入标准曲线，再乘以200即为样品的SS抗体浓度。试验组的SS抗体浓度以阴性血样的SS抗体浓度进行标准化校正，以排除非特异性吸附对结果的影响。

计算待测阴性血样的平均OD₄₅₀值(X_N)和标准偏差(S_N)，得出阴阳性临界值X_N+2S_N。若待测样品的OD₄₅₀值≥X_N+2S_N，则判为阳性；反之，则判为阴性。记录每组的阳性小鼠个数，并统计不同试验分组的抗体阳性率。

7.2.1生长抑素抗体阳性率

根据阳性血样的OD₄₅₀值≥X_N+2S_N，判断每组产生阳性抗体的小鼠个数，计算各试验组的抗体阳性率。由表6所示，pEGS/2SS免疫组和pEGS/2SS-tpa免疫组均有产生SS抗体的小鼠，且pEGS/2SS-tpa免疫组的抗体阳性率高于pEGS/2SS免疫组；不同免疫剂量处理下，高剂量组(200μg)的抗体阳性率高于中低剂量组；对不同加免次数进行分析，加免1次的抗体阳性率略高一些。因此，就抗体阳性率而言，采用高剂量(200μg)免疫2次pEGS/2SS-tpa的免疫效果最佳。

表6(a)不同疫苗组小鼠的抗体阳性率

表6(b)不同免疫剂量组的抗体阳性率

表6(c)不同加免次数组的抗体阳性率