新疆石河子地区非酿酒酵母菌多样性及其对葡萄酒呈香效应研究

摘要

非酿酒酵母菌（Non-Saccharomyces cerevisiae，NSC）是指存在于果园土壤、水果表皮与酿酒过程中，参与果酒酿造，对果酒风味影响显著的除酿酒酵母菌（S.cerevisiae）外的其他酵母菌的总称。研究表明，NSC主要通过分泌果胶酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白质水解酶等酶系，产生醇类、酯类、酸类、萜烯类等物质，从而影响果酒的品质与风味。本论文首先从新疆石河子酿酒葡萄主产区的果园土壤、不同品种葡萄，以及自然发酵醪液中分离酵母，采用传统的酵母菌鉴定方法，结合26S rDNAD1/D2区域序列分析等，对NSC菌株进行了分类鉴定及其多样性分析;然后采用气质(GC-MS)分析了NSC产生的香气成分，重点考察了典型NSC的主要香气成分及其与葡萄酒品质的相关性;最后，还初步探讨NSC在葡萄酒酿造中的应用。主要研究结果如下。
　　1.NSC的分离与鉴定
　　采集新疆石河子酿酒葡萄主产区葡萄、葡萄园土壤及发酵醪液各54、18和18份，分离得到250株NSC;采用形态学与分子生物学相结合的分类方法对这些菌株进行了鉴定与系统进化分析。结果表明，它们隶属于:假丝酵母属（Candida）、季也蒙氏酵母属（Meyerozyma）、红酵母属（Rhodotorula）、孢汉逊属（Hanseniaspora）、地霉属（Galactomyces）和毕赤酵母属(Pichia)，共6个属，10个种和6个疑似种。
　　2.NSC的产酶特性研究
　　采用β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶筛选培养基，从上述6个属的19株典型的NSC菌株中，筛选得到3株具有β-葡萄糖苷酶的菌株:Y8、Y9、Y21;3株蛋白酶水解活性的菌株:Y2、Y7、Y18;8株产淀粉酶菌株:Y13、Y2、Y14、Y7、Y18、Y8、Y20、Y15;9株产脂肪酶酵母菌:Y13、Y4、Y21、Y5、Y6、Y19、Y3、Y17、Y2。酶活分析显示，β-葡萄糖苷酶活性从高到低依次为Y9＞Y21＞Y8;蛋白酶活性依次为Y18＞Y2＞Y8，淀粉酶活性从高到低依次为Y18＞Y14＞Y13＞Y2＞Y20＞Y15＞Y8＞Y7，脂肪酶活性从高到低依次为Y17＞Y19＞Y3＞Y6＞Y20＞Y13＞Y4＞Y5＞Y21。
　　研究了pH值对NSC酶活性影响。结果显示，NSC的β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶活性的最适pH为5.5-7.0。不同菌株酶活性随温度变化的总体趋势基本一致，最适温度均为30-50℃，当温度高于50℃所有酶活性迅速下降。
　　金属离子浓度对酶活影响的结果表明，当浓度为1mmol/L时，Fe2+、Cu2+对酶活性具有不同程度的抑制作用，K+、Na+对酶活性没有明显的抑制作用，而Ca2+和Mg2+对酶活有促进作用。
　　模拟酒对酶活性的影响研究表明，高浓度的乙醇、果糖和葡萄糖对上述NSC菌株的各种酶活性均有一定抑制作用。
　　3.NSC对葡萄酒挥发性香气成分的影响
　　从上述菌株中选择Y9、Y21、Y8、Y18、Y2、Y7、Y15、Y14、Y17菌株，分别接种于自然发酵的赤霞珠葡萄酒中，以GC-MS分析，共检测到107种香气成分，其中酯类物质39种，醇类31种，酮类8种，烷烃10种，酸类15种，其他香气物质4种。
　　利用PCA和LDA分析方法对不同NSC菌株发酵葡萄酒风味物质进行分析，结果表明，该方法可以很好地区分不同菌株发酵的葡萄酒。不同菌株发酵葡萄酒挥发性成分与PC1呈明显正相关的主要有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、乙酸己酯、庚酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1丁醇等;与PC1呈明显负相关的挥发性化合物主要有丁酸乙酯、己酸乙酯和2-己烯酸乙酯。
　　进一步分析表明，Y12、Y7对3-甲基-1-丁醇，乙酸己酯、庚酸乙酯等成分有重要贡献作用;Y8、Y14对1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1丁醇等成分有贡献作用;Y2、Y18对丁酸乙酯有贡献作用;而Y9、Y17对己酸乙酯和2-己烯酸乙酯有重要贡献作用。
　　4.NSC在葡萄酒酿造中的应用
　　以上述筛选得到的Y9、Y21、Y8、Y18、Y2、Y7、Y15、Y14、Y17 NSC酵母为菌种，以工业菌株(D-254)为对照，分析了这些酵母菌耐SO2与产（耐）乙醇能力，以及发酵葡萄酒的风味等。结果显示， Y9能够耐受15％的酒精度和400 mg/Kg的SO2; Y2，在25-30℃时高产甘油和酯类，具有浓郁且纯正的香味，当总糖为203 g/L时可以产生10.2％的酒精，耐受15％的酒精和425 mg/Kg的SO2。
　　在此基础上，采用Y2与Y9为菌种，分析了它们连续混合发酵最佳工艺条件为:酵母总添加量为0.06％（Y2/Y9=1/3）时，25℃，先添加Y2，发酵54h后，添加Y9，8℃，继续发酵至120-144 h。葡萄酒酯类物质辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸己酯的含量明显高于对照(D-254)。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 非酿酒酵母简介

2 NSC的研究进展

2．1 菌种分离、鉴定

2．2 NSC对葡萄酒品质和风味的影响

2．3 NSC对葡萄酒发酵体系的影响

3 葡萄酒风味的分析方法

4 微生物多样性研究技术及其在酵母方面的应用

5 研究目的与意义

6 研究内容

第二章 NSC的筛选及鉴定

1 材料与方法

1．1 样品的采集

1．2 培养基及溶液配制方法

1 ．3 菌株筛选与保藏

1．4 菌落形态学鉴定

1．5 26S rRNA基因PCR扩增和系统进化分析

2 结果与分析

2．1 菌落形态学鉴定分析

2．2 酵母菌株的26S r RNAD1／D2鉴定与系统进化分析

3 本章小结与讨论

3．1 小结

3．2 讨论

第三章 NSC产酶特性分析

1 材料与方法

1．1 试验菌株

1．2 培养基

1．3 产β-葡萄糖苷酶NSC的筛选及酶活测定

1．4 产蛋白酶NSC的筛选及酶活测定

1．5 产淀粉酶NSC的筛选及酶活测定

3．1．6 产脂肪酶NSC的筛选及酶活测定

1．7 酶学性质研究

2 结果与分析

2．1 产酶非酿酒酵母菌的筛选分离

2．2 酶学性质研究

3 本章小结与讨论

3．1 小结

3．2 讨论

第四章 典型NSC发酵葡萄酒香气成分相关性分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 实验仪器

1．3 发酵葡萄酒

1．4 葡萄酒香气成分的GC-MS分析方法

1．5 数据分析

2 结果与讨论

2．1 不同NSC发酵葡萄酒特征香气GC-MS分析

2．2 不同NSC发酵葡萄酒的香气分布特征分析

2．3 不同非酿酒酵母菌单株发酵葡萄酒主成分分析

3 本章小结与讨论

3．1 小结

3．2 讨论

第五章 典型NSC在葡萄酒酿造中的应用

1 材料与方法

1．1 菌株

1．2 培养基

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 产酒精酵母发酵速度试验结果

2．2 产酒精酵母发酵复筛结果

2．3 产酒精酵母性能测定试验结果

2．4 产酯酵母产酯能力试验结果

2．5 产酯酵母发酵速度复筛结果

2．6 产酯酵母性能测定结果

2．7 Y9单株控温发酵生产赤霞珠干红葡萄酒的研究

2．8 Y2单株控温发酵生产赤霞珠干红葡萄酒的研究

2．9 连续混合发酵生产干红葡萄酒工艺的优化和选择

2．10 GC-MS对连续混合发酵葡萄酒香气成分的检测

3 本章小结与讨论

第六章 主要结论与展望

1．主要结论

1．1 菌种的分离与鉴定

1．2 NSC菌株的产酶特性研究

1．3 NSC对葡萄酒挥发性香气成分的影响

1．4 NSC菌株对葡萄酒酿造的影响

2 展望

论文主要创新点

参考文献

致谢

附录

攻读博士学位期间发表的论文