小鼠p27kip1的SUMO化修饰对睾丸支持细胞细胞周期的影响研究

摘要

哺乳动物成年后睾丸支持细胞的数量决定了睾丸大小和日精子产量，每个睾丸支持细胞所能供养的生殖细胞数目是一定的。细胞周期蛋白激酶抑制蛋白1Bp27Kip1(p27)，是成熟睾丸支持细胞的一个标志蛋白，p27主要通过与细胞周期蛋白激酶2（CDK2）结合影响其活性，而参与调控细胞周期进程。SUMO化修饰可以影响蛋白质的活性，稳定性，蛋白质之间的相互作用和亚细胞定位和蛋白质的运输。本研究的主要目的是探索p27能否被SUMO化修饰，确定p27的SUMO化修饰位点，并阐明p27的SUMO化修饰对睾丸支持细胞细胞细胞周期的影响。
　　实验设计如下:
　　本课题首先用免疫组织化学和western blot的方法检测p27在0天、4天、10天和42天小鼠睾丸中的定位和表达情况(Takuya Sato et al2011)。利用敏感型细胞、CHO-K1作为实验材料，通过转染SUMO-1、UBC9、p27和p27点突变载体，探讨p27的SUMO化修饰模式，筛选p27的SUMO化修饰位点以及SUMO化修饰对p27稳定性的影响。分离培养7天小鼠睾丸支持细胞，转染p27和p27点突变载体，流式细胞仪检测细胞周期。
　　实验结果:(1) p27在各个时期的睾丸中均有表达，而且存在磷酸化，泛素化和SUMO化等多种蛋白翻译后修饰，p27在10天的小鼠睾丸中表达水平显著高于其它时，主要定位于生殖细胞、部分支持细胞和间质细胞的细胞核内，而42天小鼠睾丸中主要定位于支持细胞的细胞核内;(2) p27可以被SUMO-1修饰，修饰发生在Lys189和Lys190，需要Lys189和Lys190同时突变才能阻断p27的SUMO-1修饰作用，并且SUMO-1修饰位点突变后p27的蛋白水平显著下降（P＜0.05）;(3)睾丸支持细胞转染p27后，细胞周期G1期显著增加（P＜0.05），转染p27K190R突变载体后细胞周期G1期显著增加（P＜0.05），2种突变p27 K189R和p27 K189AK/190R质粒转染后对细胞周期没有影响。
　　综上所述，本研究筛选出小鼠p27的SUMO化修位点是Lys189，p27的SUMO化修饰可以增强p27的稳定性，并使支持细胞的细胞周期阻滞在G1期。该研究结果为研究睾丸癌机制及p27功能的研究提供理论依据，为提升雄性动物繁殖性能提供新的思路。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 细胞周期

1．1．1 细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶

1．2 细胞周期蛋白激酶抑制蛋白1B

1．2．1 p27对细胞周期的调控

1．2．2 p27的表达调控

1．2．3 p27的磷酸化修饰和泛素化修饰

1．2．4 p27的亚细胞定位

1．2．5 p27在睾丸发育中的表达规律

1．3 SUMO化修饰

1．3．1 SUMO化修饰与细胞周期

1．3．2 SUMO化修饰与蛋白的亚细胞运输

1．4 支持细胞的增殖和功能性成熟

1．4．1 支持细胞的增殖

1．4．2 支持细胞的功能性成熟

1．4．3 p27和p21调节睾丸支持细胞的增殖

1．5 小结

2 研究目的和意义

3 材料和方法

3．1 p27真核表达载体的构建

3．1．1 材料、试剂

3．1．2 培养基

3．1．3 仪器

3．1．4 方法

3．2 免疫组织化学

3．2．1 材料和试剂

3．2．2 实验动物

3．2．3 溶液、缓冲液配制

3．2．4 组织固定

3．2．5 组织石蜡包埋和组织切片

3．2．6 免疫组化染色

3．3 Western blot

3．3．1 材料和试剂

3．3．2 溶液、缓冲液的配制

3．3．3 仪器

3．3．4 操作步骤

3．4 小鼠睾丸支持细胞的分离培养

3．4．1 试剂、溶液和实验动物

3．4．2 仪器

3．4．3 小鼠睾丸支持细胞的分离和培养方法

3．5 小鼠睾丸支持细胞转染

3．5．1 试剂、溶液

3．5．2 仪器

3．5．3 转染方法

3．6 细胞增殖检测

3．6．1 试剂

3．6．2 仪器

3．6．3 检测方法

3．6．4 统计学分析

3．7 免疫荧光细胞化学

3．7．1 材料、试剂

3．7．2 操作方法

3．8 式细胞仪测定细胞周期

3．8．1 试剂

3．8．2 仪器设备

3．8．3 操作方法

3．8．4 统计学分析

4 结果与分析

4．1 p27在不同日龄小鼠睾丸中的表达和定位

4．1．1 免疫组织化学检测不同日龄小鼠睾丸中p27的定位

4．1．2 Westen blot检测不同日龄小鼠睾丸p27的表达水平

4．2 小鼠p27的SUMO化修饰位点的预测

4．3 p27真核表达载体的构建

4．3．1 小鼠p27基因cDNA的克隆

4．3．2 小鼠CDNK1B基因真核表达载体的构建和鉴定

4．3．3 小鼠CDNK1B基因SUMO修饰位点突变载体的构建

4．4 小鼠p27Kipl的SUM01修饰的验证和SUMO1修饰位点的筛选

4．4．1 小鼠p27Kip1在K189被SUMO化修饰

4．4．2 免疫共沉淀检测p27的SUMO化位点

4．5 p27的SUMO-1修饰对支持细胞周期的影响

4．5．1 支持细胞最佳转染效率的检测

4．5．2 p27的SUMO-1修饰促进支持细胞的G1期阻滞

5 讨论

5．1 p27的SUMO-1修饰

5．2 p27的SUMO-1修饰影响其稳定性

5．3 p27的SUMO-1修饰影响p27对支持细胞G1期的阻滞

5．4 总结

5．5 本文不足之处与下一步计划

参考文献

致谢