FSH通过Skp2、p27kip1调节仔猪睾丸支持细胞的增殖

摘要

睾丸支持细胞(Sertoli cell，SC)是影响精子生成的最重要的因素，SC与生精细胞数量比例保持恒定是生精细胞分化的一个重要条件，SC的数量决定了成年动物睾丸产生精子的数量。SC的增殖受多种因素的调节，在所有影响的激素和因子中，FSH是调节SC增殖过程最重要的激素之一，而Skp2是调节细胞增殖的关键性因子，能与发生泛素化的p27kip1。结合，促使p27kip1在26S的蛋白酶体上发生降解，促进细胞进程。
　　 本研究拟以2～3周龄的仔猪为研究对象，以FSH调节Skp2的表达为核心，以培养的仔猪睾丸支持细胞为实验材料，通过添加各种信号通路的抑制剂，运用Western blot检测Skp2、p27kip1蛋白的表达，运用实时荧光定量PCR检测Skp2 mRNA的表达，为进一步认识促卵泡素调节睾丸支持细胞增殖的分子机制奠定基础。
　　 实验结果如下：
　　 (1)FSH促进了Skp2蛋白的表达，30min时，蛋白的量最大，此后Skp2的表达有所下降，到90min时，Skp2蛋白的表达量与对照相比无明显差异。同时FSH也促进了Skp2 mRNA的表达，加入FSH15min后，Skp2 mRNA的表达明显增加，与对照组相比增加了11.56倍(P<0.05)，在30min时，Skp2 mRNA表达量最高，是对照组的17.76倍(P<0.05)，此后其表达水平有所下降。
　　 (2)加入cAMP的促进剂Forskolin(10uM)与FSH一样均明显促进了Skp2蛋白的表达，抑制了p27kip1蛋白的降解；而cAMP的抑制剂Rp-cAMP(20 uM)单独作用时对Skp2、p27kip1蛋白的表达无明显影响，但抑制了FSH对Skp2、p27kip1蛋白的作用。
　　 (3)Ca2+通道抑制剂(Verapamil)(0.05mg/ml)单独作用时对Skp2、p27kip1蛋白的表达无明显影响，但抑制了FSH对Skp2、p27kip1蛋白的作用。FSH单独作用时细胞中Skp2 mRNA表达水平与对照组相比增加了7.14倍，加入Verapamil后细胞内Skp2mRNA的水平有所下降，仅为FSH单独作用时的67.45％(P<0.05)。Verapamil单独作用时对于Skp2 mRNA的表达与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
　　 (4)ERK的抑制剂U0126单独作用时对Skp2、p27kip1蛋白的表达无明显影响，但抑制了FSH对Skp2、p27kip1蛋白的作用。U0126对Skp2 mRNA的表达也无明显影响(P>0.05)，但当U0126与FSH共同作用时Skp2 mRNA的表达明显下降，与FSH单独作用相比降低了53.0％(P(0.05)。
　　 综上所述，本实验可以得到如下结论：
　　 (1)FSH(50ng/ml)以时间依赖的方式促进了Skp2的表达，这一作用在30min时达到最佳效果；
　　 (2)FSH通过cAMP的产生和促进Ca2+的内流激活ERK1/2级联，并通过ERK1/2级联诱导Skp2 mRNA和蛋白的表达；
　　 (3)细胞中Skp2的水平与p27kip1的水平成负相关。