植物微型反向重复转座子数据库(P-MITE)的构建和烟草中TMV侵染后无症状表型控制基因的遗传克隆

摘要

本文研究内容包括三个部分，下面将分别从三个部分进行论述:
　　1、植物中微型反向重复转座子数据库(P-MITE)的构建
　　微型反向重复转座子(miniature inverted-repeat transposable element, MITE)是一类长度较短的非自主型转座子，具有DNA转座子相似的结构，如末端反向重复(terminal inverted repeats，TIR)和正向序列重复(target site duplication, TSD)。与DNA转座子不同，MITE在基因组中有很高的拷贝，倾向于插入基因内或基因附近。MITE与基因的高度相关性可能预示着MITE在基因的调控中有着重要作用，可能是基因组进化和物种分化的动力之一。虽然关于MITE的研究有诸多报道，但由于缺乏各物种全基因组的MTIE信息和可以数据共享的平台，MITE的研究相对迟缓，特别是MITE的大规模组学分析。本研究中，我们利用软件MITE Digger、MITE-Hunter和我们实验室自己开发的程序RSPB从41个已经测序的植物基因组中从头鉴定MITE。对于每一个MITE家族，我们至少手工鉴定了1条种子序列，来确保MITE鉴定的可靠性。包括之前在水稻中鉴定的MITE序列，我们一共得到了3，527个MITE家族，共计2，332，901条MITE序列。不同物种中MITE家族和拷贝数都不同，总体而言高等植物中具有更多数量的MITE。物种MITE数量的大小与物种基因组大小正相关，表明MITE在基因组的进化中起着一定的作用。我们从水稻、玉米、小米和马铃薯基因中共发现了10个具有潜在跳跃活性的MITE组，每组均含有至少20个相同的MITE拷贝。为了方便MITE的研究，我们构建了MITE数据库网站(P-MITE，网址为http://pmite.hzau.edu.cn/，)，用以存储本研究中产生的所有MITE数据，并在P-MITE数据库中提供了序列浏览、检索、BLAST和下载等功能。P-MITE平台的搭建将有利于促进人们对MITE起源、MITE扩增和MITE对基因的调控方式等方面的研究。
　　2、结合RNA-seq和BSA进行基因遗传定位的方法开发
　　混合池分组分析法(Bulk segregant analysis，BSA)是一种可以快速找到与目标基因连锁的分子标记的方法。将第二代测序和RNA-seq测序技术结合起来，可以快速找到与目的表型相关的基因组区域。目前已有多种方法可以用来进行BSARNA的分析，但这些方法的应用需要被研究物种有较好的参考基因组。本研究中，我们开发了一个利用BSARNA进行数据分析的方法，snpMapper，并将该方法应用到3个不同群体的BSARNA数据分析中。结果表明，snpMapper均可以在3个数据集中找到与目标基因相关的染色体区段，在没有较好参考基因组的情况下，snpMapper也可以找到与目标基因紧密连锁的单核苷酸多态性位点（single nucleotidepolymorphism，SNP）。因此，snpMapper是一个有效的BSA RNA-seq数据分析方法。
　　3、烟草中控制TMV侵染后产生无症状表型的基因的定位和克隆
　　病毒在宿主体内的有效复制需要宿主提供合适的因子。尽管在过去的研究中报道了诸多植物体内参与病毒复制的宿主因子，但烟草中此类参与烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)复制的宿主因子没有报道。本研究中，我们通过图位克隆的方法在四倍体烟草中克隆到了2个参与烟草花叶病毒TMV-U1株系互作的宿主因子:NtTOM2A-Ntom和NtTOM2A-Nsyl。遗传分析发现这2个基因是分别位于2个亚基因组上的同源基因(homoeologous gene)。2个基因同时发生突变，使得TMV病毒在烟草中的积累量大幅度下降，从而导致了symptomless表型。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现，NtTOM2A在烟草不同组织中均有表达，在根中的表达水平略高，在接种病毒前后表达水平没有明显的变化。我们通过标记辅助选择构建了NtTOM2A-Nsyl的一个近等基因系，并对近等基因系及对照TI203进行了转录组分析。转基因实验表明，来自11个物种的TOM2A均保留有协助TMV复制的功能。此外，我们还构建了番茄中SlTOM2A的转基因RNAi干涉系，鉴定了8株SlTOM2AmRNA水平被显著抑制的T0代转基因阳性苗。这些转基因材料将用于分析通过降低SlTOM2A mRNA表达水平，是否可以降低TMV在宿主内的积累量，从而培育抗TMV的番茄材料，为高抗育种提供新思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 植物微型反向重复转座子数据库(P-MITE)的构建

1．1 前言

1．1．1 转座子

1．1．2 植物中的微型反向重复转座子(MITE)研究进展

1．1．3 本研究的意义和目的

1．2 材料与方法

1．2．1 基因组数据

1．2．2 软件及工具

1．2．3 MITE的鉴定方法和流程

1．2．4 MITE的手工注释

1．2．5 MITE超家族、亚家族的分类及序列命名

1．2．6 活跃MITE的鉴定

1．2．7 P-MITE数据平台的构建

1．3 结果与分析

1．3．1 各物种中MITE的鉴定、家族划分与比较

1．3．2 MITE与基因组大小的关系

1．3．3 本研究鉴定的MITE与其他已知转座子数据库的比较

1．3．4 植物中的活跃MITE

1．3．5 P-MITE数据库的构建及其功能概述

1．4 讨论

1．4．1 MITE物种分布的广泛性

1．4．2 MITE的进化

1．4．3 植物中的活跃MITE

1．4．4 MITE开放数据平台的建立

1．4．5 后续工作展望

第二章 利用RNA-seq和混合池分析法(BSA RNA)进行基因定位的方法开发

2．1 前言

2．1．1 测序技术的发展

2．1．2 第二代测序在基因组学研究中应用

2．1．3 第二代测序在植物遗传学研究的应用

2．2．1 使用的软件和工具

2．2 材料与方法

2．1．4 课题的由来和意义

2．2．2 测试数据来源

2．3 结果与分析

2．3．1 snpMapper的原理和分析流程

2．3．2 snpMapper在定位单基因控制性状中的应用

2．3．3 snpMapper在定位数量性状(QTL)位点的应用

2．3．4 snpMapper在具有复杂基因组物种中基因定位中的应用

2．4 讨论

2．4．1 第二代测序和BSA相结合的分析策略可以有效实现基因的快速定位

2．4．2 进行BSA-RNA的样品准备原则和数据要求

2．4．3 运用snpMapper在多基因控制性状的分离群体中的应用

2．4．4 复杂基因组物种中的BSA-RNA分析

2．4．5 snpMapper需要改进的地方

第三章 烟草中控制TMV侵染后产生无症状(symptomless)表型的基因的遗传克隆及分析

3．1 前言

3．1．1 植物对病原菌的抗病表现

3．1．2 植物的抗病基因及其抗病机制

3．1．3 植物抗病基因的克隆方法

3．1．4 烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)

3．1．5 课题的由来及研究意义

3．2 材料与方法

3．2．1 基因组及软件工具

3．2．2 实验材料

3．2．3 TMV的繁殖和接种

3．2．4 植物总蛋白的提取

3．2．5 植物体内TMV量的Western blot检测

3．2．6 近等基因系的构建及数据分析

3．2．7 生物信息学分析

3．2．8 CAPS分子标记的开发

3．2．9 转化载体的构建

3．2．10 遗传转化

3．2．11 转基因苗的阳性鉴定

3．2．12 DNA提取及PCR反应体系

3．2．13 RNA提取，RT-PCR和qRT-PCR

3．2．14 不同物种中TOM2A同源体的获得

3．3 结果与分析

3．3．1 亲本SR1和TI 203接种TMV-U1后的表型及TMV量的比较

3．3．2 无症状表型的的遗传机理

3．3．3 SR1和TI 203基因组重测序及单核苷酸多态性(SNP)标记的鉴定

3．3．4 TTSL1基因的初定位

3．3．5 基于微线性的比较基因组学开发精细定位TTSL1的分子标记

3．3．6 TTSL1基因的精细定位

3．3．7 TTSL1的候选基因选择及分析

3．3．8 TTSL1的转基因功能验证

3．3．9 TTSL2基因的克隆和功能验证

3．3．10 烟草中和拟南芥中TOM2A基因的序列分析

3．3．11 烟草中的TOM2A基因抗性的起源分析

3．3．12 NtTOM2A在烟草组织器官中的表达分析

3．3．13 野生烟草中的symptomless表型与TOM2A的关系

3．3．14 不同物种中TOM2A同源体的功能研究

3．3．15 近等基因系的构建及近等基因系的转录组分析

3．3．16 番茄SlTOM2A基因沉默系的构建及TMV抗性研究

3．4 讨论

3．4．1 RNA-BSA可以实现复杂基因组物种中基因的快速定位和克隆

3．4．2 基于共线性的比较作图和候选基因的选择

3．4．3 从TTSL2基因快速克隆到对多倍体物种中基因定位的思考

3．4．4 NtTOM2A基因的表达分析

3．4．5 NtTOM2A基因转录组分析

3．4．6 TOM2A的进化分析

3．4．7 TOM2A在非寄主抗性中的作用

3．4．8 通过抑制TOM2A的表达水平培育抗TMV材料

3．4．9 后续工作展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间发表的论文或参与的工作

致谢