沉默抑制子CMV 2b基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建

摘要

从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本,取ELISA检测阳性反应最强的样本提取总RNA.设计特异性引物扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序.其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸.将来源于安徽烟草的CMV 2b基因与其它CMV 2b基因进行序列比对,结果表明,来源于安徽烟草的CMV2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8%.构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近.以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段CMV 2b(r)和反向片段CMV 2b(i).先后将反向片段CMV 2b(i)和正向片段CMV 2b(r)分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b(r)-In-2b(i).再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i).