CMV和ToMV嵌合基因反向重复植物表达载体的构建及遗传转化

摘要

黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）和番茄花叶病毒（Tomatomosaicvirus,ToMV）是危害茄科植物的两种主要病毒，常以复合侵染的方式对作物造成严重的危害，是造成新疆加工番茄坏死条斑病的重要因素。利用基因沉默原理，将病毒本身的一些基因转化到植物基因组中，使之表达病毒来源的dsRNA，诱导RNA沉默获得抗病毒植株是当前抗病毒转基因的主要途径。本研究以严重危害新疆加工番茄的2种病毒CMV与ToMV为目标，将ToMV部分移动蛋白基因(△MP)和CMV的部分复制相关蛋白基因（△Rep）进行嵌合，构建成能自我互补的发夹型RNA（hpRNA）结构，以农杆菌法转化到烟草和加工番茄，希望获得能够同时抗CMV和ToMV的转基因烟草和转基因加工番茄。
　　1、CMV部分复制酶（△Rep）基因和ToMV的运动蛋白（△MP）基因的获得
　　从田间采集表现坏死条斑症状和表现花叶及蕨叶症状的加工番茄病株，分别根据ToMVMP基因和CMVRep基因序列分别设计特异性引物MP-F/MP-R和Rep-F/Rep-R，分别对病株进行相应目标基因的RT-PCR、克隆和测序，结果获得795bp和546bp核苷酸序列。基因库检索表明，它们分别为ToMVMP基因和部分CMVRep基因。
　　2、嵌合基因△MP-Rep反向重复植物表达载体的构建
　　根据已测ToMVMP基因和CMVRep基因的序列设计特异性引物和中间引物，通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合，获得长度为711bp的融合基因△MP-Rep。将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连，得到含有融合基因反向重复序列的重组质粒pBlueSK-Intron△MP-Rep(i/r)。再用限制性内切酶BamHI切下包含Intron在内的反向重复的融合基因，并定向插入到植物表达载体pBIN438上，构建了含两种病毒基因的植物表达载体pBIN438△MP-Rep（i/r）。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。
　　3、含△MP-Rep基因的植物双元重组表达载体的农杆菌转化及抗性植株的再生
　　利用三亲交配法将带有△MP-Rep基因反向重复的植物表达载pBIN438△MP-Rep(i/r)转入到根癌农杆菌EHA105中，通过PCR和酶切鉴定阳性的转化子用于烟草和加工番茄的转化。经卡那霉素与羧苄青霉素抗性筛选分别获得转融合基因△MP-Rep的再生烟草植株40株和加工番茄植株11株，所有植株的PCR检测均为阳性。本研究结果为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础。

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引 言

第一章 文献综述

1.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性及基因组结构

1.2 番茄花叶病毒的生物学特性及基因组结构

1.3 复制酶和运动蛋白的主要功能

1.4 植物抗病毒的研究进展

1.5 RNA沉默与植物抗病毒

1.6 本研究的目的意义

第二章 黄瓜花叶病毒和番茄花叶病毒目标基因的获得

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果越分析

2.4 讨论

第三章 dsRNA介导的双价抗病毒沉默载体的构建

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 结论和讨论

第四章 转△MP-Rep基因烟草和加工番茄的遗传转化

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 结论和讨论

全文小结

前景展望

参考文献

附 录

致谢

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