miR-200家族在斑马鱼生殖发育中的功能研究

摘要

斑马鱼miR-200家族(miR-200s)有六个成员:miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429a和miR-429b，分布在斑马鱼的6号和23号染色体上。我们之前的研究发现miR-200家族基因在斑马鱼胚胎发育过程中调控胚胎的体长，然而miR-200在成鱼中的功能还鲜有报道。本研究旨在探索miR-200家族在成鱼斑马鱼生殖发育中的功能。通过CRISPR/CAS9基因编辑技术，我们删除了斑马鱼基因组上miR-200家族的6个前体。6号染色体上miR-200家族成员(miR-141、miR-429b和miR-200c)敲除的突变体斑马鱼（下文简称6号miR-200敲除系，chr6-miR-200-KO）没有出现任何异于野生型(WT)斑马鱼的表型;23号染色体上miR-200家族成员(miR-200b、miR-200a和miR-429a)敲除的突变体(下文简称23号miR-200敲除系，chr23-miR-200-KO)雄鱼的精子运动能力显著高于WT斑马鱼，同时23号miR-200敲除系雌鱼不能正常繁殖。
　　在雄鱼中，通过解剖观察WT和突变体的精巢形态和HE切片的组织学分析，发现两种突变体与WT相比并无任何异常;而后通过计算机辅助精子分析系统(CASA)检测了斑马鱼的精子运动能力，分析结果显示6号miR-200敲除系突变体的精子运动能力与WT斑马鱼无显著性差异，然而23号miR-200敲除系突变体的精子运动能力显著高于WT斑马鱼和6号miR-200敲除系突变体。通过targetscan软件在线预测与精子生成及精子运动能力相关的miR-200的靶基因，我们筛选出了amh、wt1a和srd5a2b三个候选靶基因，并且在WT和23号miR-200敲除系突变体中的定量PCR结果也证实它们与miR-200的靶向关系。体外荧光素酶报告系统的结果显示，miR-200a、miR-200b、miR-429a能够靶向结合amh、wt1a和srd5a2b的3'UTR。在体内，通过在成鱼中注射miR-200a、miR-200b、miR-429a稳定的模拟物以达到模拟过表达miR-200a、miR-200b、miR-429a的目的，结果显示过表达miR-200a、miR-200b、miR-429a的雄鱼的精子运动能力显著下降，同时精巢中amh、wt1a和srd5a2b的表达也显著下调。之前的实验结果证实p53是miR-200的直接上游，而后我们检测了p53突变体中的miR-200a、miR-200b和miR-429a的表达，发现突变体中这三者的表达量异常低于WT;通过CASA检测发现，p53突变体的雄鱼精子运动能力显著高于WT。WT斑马鱼雄鱼的梯度雌二醇浸泡实验结果显示，梯度的雌二醇可以诱导miR-429a梯度上调表达和精子运动能力的下降，同时p53的表达显著上升，然而对p53突变体进行同样的雌二醇浸泡操作发现p53突变体的精子运动能力并没有受到雌二醇的影响。于是，我们得出以下结论:雌二醇可通过激活p53途径直接作用于miR-200a、miR-200b和miR-429a，影响下游靶基因amh、wt1a和srda2b的表达，导致最终的精子运动能力受影响。
　　在雌鱼中，我们发现23号miR-200敲除系突变体不能正常繁殖，而6号miR-200敲除系突变体的生殖能力与WT斑马鱼无异。通过对性成熟的斑马鱼雌鱼进行解剖及切片的比较观察，发现6号miR-200敲除系和23号miR-200敲除系突变体与WT的卵巢没有差异，并且23号miR-200敲除系突变体和WT一样，里面各个时期的卵母细胞都存在，并无差异。而后，通过更细致的观察，我们发现23号miR-200敲除系突变体雌鱼和WT的卵细胞均可正常发育到Ⅵ期，并且均可在体外诱导达到最终的卵母细胞成熟阶段。通过hCG的催产挽救，23号miR-200敲除系突变体可以被部分挽救，并且催产后突变体中的卵细胞均透明达到排卵前的阶段，但大部分突变体的成熟卵细胞不能从滤泡细胞中脱落进入卵巢腔，不能人工挤出自由的卵细胞。促性腺激素的主要成分为LH和FSH，在斑马鱼中，fshb突变体雌鱼没有出现任何生殖障碍，所以我们锁定LH在整个排卵过程中发挥着非常重要的作用。通过qPCR的检测，发现在突变体中lhb的表达明显低于WT，同时我们检测了在23号染色体上的miR-200s的靶基因wt1a的表达，并且验证了lhb的启动子活性可以有效的被Wt1a蛋白抑制。于是我们得出结论23号染色体上的miR-200通过调控下游靶基因wt1a的转录来调控lhb的表达。那LH又是如何影响斑马鱼的成熟及排卵的呢？我们猜测这一系列的排卵缺陷是由LH的下降引起下游的孕激素及前列腺素在排卵过程中的不足导致的。于是我们验证这两个激素在排卵中的作用。在WT斑马鱼排卵前，DHP在早上5点半左右达到最高水平，通过注射DHP发现和hCG挽救结果一致，23号miR-200敲除系突变体雌鱼可以被部分挽救，这也就证实了我们的一个猜想，突变体的生殖障碍有一部分原因是由于LH下调导致排卵前孕酮供应不足导致不能正常成熟及排卵。另一方面，通过检测发现ptgs2a在排卵前显著上升，然而前列腺素PGE2和PGF2并不能挽救23号miR-200敲除系突变体雌鱼。与此同时，我们构建了斑马鱼ptgs2a敲除的突变体来确定前列腺素在生殖过程中的作用，结果发现ptgs2a突变体雌鱼是可育的，并没有出现任何排卵障碍。于是我们得出结论，前列腺素并没有参与miR-200调控LH诱导卵细胞成熟及排卵的这个过程。总结23号染色体上的miR-200成员在雌鱼中的作用，我们得出以下结论:斑马鱼23号染色体上的miR-200成员miR-200a、miR-200b和miR-429a可以通过靶向结合转录抑制因子wt1a来调控lhb的表达，而下调了的LH不能诱导产生足够的DHP导致成熟及排卵的失败。
　　综上所述，我们认为位于23号染色体上的miR-200家族成员在斑马鱼成鱼的生殖系统中发挥着重要作用，分别影响了雄鱼的精子运动能力和雌鱼的排卵。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 microRNAs概述

2 miRNAs的研究方法概述

2．1 生物信息学

2．2 实验生物学

3 miR-200的研究进展

3．1 miR-200家族基因

3．2 miR-200家族的功能研究进展

4 实验动物斑马鱼的研究优势

5 斑马鱼的性腺

5．1 性腺的形成

5．2 斑马鱼的精巢

5．3 斑马鱼的卵巢组织

6 基因编辑技术

7 研究目的和意义

1．1 实验动物和细胞

1．2 实验载体、菌株和抗体

1．3 主要仪器设备

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 RNA抽提

2．2 RNA逆转录

2．3 荧光定量PCR

2．4 DNA纯化回收

2．5 质粒构建

2．6 细胞实验

2．7 显微注射

2．8 DNA的提取

2．9 突变体的构建

2．10 腹腔注射及激素浸泡

2．11 计算机辅助精液分析(Computer-Aided Sperm Analysiss，CASA)

2．12 组织切片苏木精-伊红(HE)染色

2．13 Western blot

2．14 产卵与可育性生殖鉴定策略

2．15 卵细胞的体外成熟诱导

2．16 卵巢中DHP及LH激素含量的测定

2．17 数据分析

第三章 实验结果

1．2 miR-200家族成员突变体的构建

1．3 23号染色体上的miR-200敲除突变体雄鱼的精子运动能力上升

1．4 amh、wtla和srd5a2b是miR-200的靶基因

1．5 miR-200b、200a和429a的过表达降低斑马鱼的精子运动能力

1．6 雌激素的处理降低了野生型斑马鱼的精子运动能力，同时miR-429a的表达量上升

1．7 雌激素的处理并不能降低p53突变的斑马鱼精子运动能力

2 miR-200在斑马鱼雌鱼性腺中的功能研究

2．2 23号miR-200敲除系突变体雌鱼中miR-200表达量下调显著

2．3 23号miR-200敲除系突变体不能正常排卵

2．4 23号miR-200敲除系突变体的挽救

2．5 促黄体激素LH在23号miR-200敲除系突变体中下调

2．6 miR-200通过wtla来抑制促黄体激素LH的表达

2．7 DHP能够部分挽救突变体的排卵

2．8 前列腺素不参与miR-200调控LH的排卵过程

第四章 讨论

1 斑马鱼23号染色体上的miR-200s影响雄鱼精子运动能力

2 斑马鱼23号染色体上的miR-200s影响雌鱼排卵

参考文献

附录

致谢