miR-200家族在鱼类精巢和胚胎发育中的表达和功能研究

摘要

MicroRNAs(miRNAs)在脊椎动物的性别分化和性腺发育过程中发挥重要调控作用。黄颡鱼作为我国性别异形经济鱼类的代表，其雌、雄性腺的miRNAs表达谱均未见报道，此外黄颡鱼性腺发育的分子机制仍不清楚。本研究首先通过Solexa深度测序技术检测了3种类型的黄颡鱼性腺（XX型雌鱼卵巢，XY型雄鱼精巢以及YY超雄鱼精巢）。测序数据产生了384个保守的miRNA s和113个潜在的新miRNAs，其中分别有23，30和14个miRNAs在XX卵巢，XY精巢以及YY精巢中特异表达。研究发现黄颡鱼性腺中一些性别差异表达的miRNAs，在其他脊椎动物中也呈现出相似的性别相关的表达模式。我们还观察到miR-200家族成员(包括miR-141和miR-429)在XY精巢的表达水平均比YY精巢的低。组织学分析显示YY超雄鱼的精巢比XY雄鱼的精巢成熟度要高，因为YY超雄鱼的精巢有更大的精小囊，且精小囊中有更多的精细胞和更少的精母细胞。此外，当用高浓度的雌激素处理XY型雄性黄颡鱼，损害其精巢发育和细胞增殖时，5个miR-200家族成员在精巢中的表达水平均显著上调。黄颡鱼miR-141和miR-429的表达水平随着精巢发育的进程而表达下调，该现象与人类中的报道一致。最后，通过荧光定量PCR检测了随机挑选的9个miRNAs，它们在黄颡鱼性腺的表达模式与高通量测序结果一致。我们的研究结果为不同性别类型黄颡鱼性腺miRNAs转录组分析提供了较为全面的信息，并初步证实了miR-200家族参与调控精巢发育和精子生成。
　　脊椎动物中growth hormone/insulin-like growth factor(GH/IGF)轴在躯体生长方面发挥了重要的调控作用。GH/IGF轴基因的表达水平与一些哺乳动物以及水产养殖鱼类的生长速度的快慢呈正相关。然而GH/IGF轴基因在发育早期的直接调控机制仍不清楚。miR-200家族在脊椎动物中非常保守，它在果蝇中的唯一同源成员是miR-8。MiR-8/200s在躯体生长方面的功能最先在果蝇中发现，被认为是促进生长的因子。但miR-200家族在脊椎动物中是否具有调控生长的作用未见报道。对斑马鱼的研究揭示了保守的miR-200家族成员能够调控胚胎大小，他们主要通过靶向一些GH/IGF轴基因(GH，GHRa，GHRb和IGF2a)来发挥作用。过表达miR-200s成员导致细胞停滞在G1期，并且在胚胎时期诱导凋亡反应，因而抑制斑马鱼胚胎的躯体生长。值得注意的是，GH能诱导p53和miR-200s的表达，miR-200s又是p53的潜在转录靶基因，而在p53突变的胚胎中，GH过表达不能诱导miR-200家族上调。结合以上实验结果，我们得出结论，p53/miR-200s和GH/IGF信号途径形成了一个调控胚胎大小的负反馈路线。这为“硬骨鱼发育早期身体生长是如何确定的”这一长期存在的难题提供了重要的见解。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 miRNA概述

1．1 miRNA的发现

1．2 miRNA的生物合成过程

1．3 miRNA的作用机制

1．4 miRNA的功能

2 miRNA的研究方法

2．1 传统实验方法

2．2 微阵列芯片技术

2．3 新一代测序技术

2．4 生物信息分析

2．5 功能研究

3 miR-8／miR-200家族

3．1 基因结构及成熟miRNA序列

3．2 miR-8／miR-200家族的进化关系

3．3 miR-8／miR-200家族的多重功能

4 实验动物研究背景

4．1 黄颡鱼

4．2 斑马鱼

5 研究目的和意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 所用载体

1．3 主要仪器设备

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 RNA抽提

2．2 小RNA库建立及测序

2．3 Illumina测序结果处理

2．4 小RNA库中miRNA表达谱分析

2．5 RNA逆转录

2．6 荧光定量PCR

2．7 HE染色

2．8 激素处理

2．9 动物基因组DNA提取

2．10 质粒构建

2．11 体外转录合成mRNA

2．12 显微注射

2．13 胚胎整体原位杂交(WISH)

2．14 胚胎凋亡检测

2．15 蛋白实验

2．16 293T细胞实验

2．17 数据分析

第三章 结果与分析

1 黄颡鱼性腺miRNA的转录组分析

1．1 RNA质检结果

1．2 测序数据产出总览

1．3 各类RNA数据库比对结果

1．4 黄颡鱼性腺miRNAs的表达模式

1．5 荧光定量验证结果

1．6 一龄XY和YY精巢的组织学差异及miR-200家族的表达差异

2 miR-200家族在斑马鱼生长发育方面的功能研究

2．1 miR-200家族成员在胚胎发育时期的表达模式

2．2 miR-200家族成员调控生长激素内分泌轴的基因表达

2．3 miR-200调控斑马鱼胚胎的正常体长生长

2．4 胚胎发育时期过表达miR-200抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡

2．5 生长激素内分泌轴的多个关键基因是miR-200s的直接靶基因

2．6 生长激素依赖P53调控miR-200s的表达

2．7 miR-200启动子中潜在的p53结合位点与启动子活性相关

第四章 讨论

1 黄颡鱼性腺miRNAs表达模式及miR-200家族参与精巢发育

2 p53／miR-200s与GH／IGF轴反馈调控斑马鱼胚胎大小

参考文献

发表论文

获奖情况

致谢