斑马鱼胚胎发育的表观遗传调控—SET家族组蛋白甲基转移酶在胚胎发育过程中的表达和功能研究

摘要

本文对斑马鱼SET基因家族在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱和功能进行了研究，这些具有SET结构域的蛋白家族是一类在进化上高度保守的表观遗传学调控因子，负责修饰大部分的组蛋白赖氨酸的甲基化。有些该蛋白家族的成员已被证实在胚胎发育过程中发挥关键作用，鉴于斑马鱼这一脊椎动物模型的某些优势，我们推测可以用之研究SET基因在胚胎发育过程中的生物学功能及其表观遗传学调控机制。 第一部分我们从全基因组水平对斑马鱼的SET基因进行了搜索，共有58个SET基因被识别鉴定，尽管基因的复制事件等进化因素导致了一些种系特异的基因的产生，在斑马鱼和人类SET基因之间清楚的同源关系仍然说明了这类基因在进化上的高度保守，我们对这些蛋白序列数据进行了进化和结构域组成分析，并将它们进一步分成了十个亚家族。通过全胚胎原位杂交的办法，我们对所有这些基因在发育过程中的表达谱进行了系统的描述。通过此方法我们发现了一组母系表达的SET基因，这些基因的酶修饰活性包括了所有已知的组蛋白甲基化位点，提示它们在早期发育的组蛋白修饰调控程序中的重要作用。另外我们还发现了一些SET基因在特定的发育阶段特定的组织器官中表达，提示表观遗传机制在这些器官的发生中发挥作用。这些结果为斑马鱼SET基因从进化和发育的角度提供了一个较整体的描述，并为系统研究这类基因在发育中的生物学功能奠定了基础。 第二部分我们对上述斑马鱼SET基因的一个成员-setdb2进行了深入的研究，这个基因的表达早在胚胎期一个细胞阶段即可检测到，并在原肠期和体节形成期高表达，对其进行morpholino-knockdown实验发现它的功能缺失会导致胚胎整体组蛋白H3K9me3水平的降低，并导致胚胎器官的正常左右不对称分布和左右不对称基因正常表达位置的打乱，这种身体左右不对称图式的扰乱是由于setdb2 knockdown导致的斑马鱼胚胎器官Kupffer’svesicle(KV)中纤毛数量的减少和中线发育的异常引起的，进一步的研究发现，setdb2 knockdown导致了“背侧组织者(dorsal organizer)”区域基因goosecoid(gsc)，chordin(chd)和floaring head(flh)的过度表达，而之前其他工作组的实验证明这些基因的过度表达会导致中线的过度发育和次生胚轴的形成；根据以上结果我们认为setdb2的生物学功能是通过其H3K9me3甲基转移酶活性对某些未知基因的表观遗传学调控作用将背侧组织者的发育维持在合适的大小。在setdb2功能缺失的胚胎中，这些未知基因的过度表达引起背侧组织者的过度发育，进而直接或间接导致了背侧前驱细胞群(Dorsal Forunner Cells)的迁移和分化障碍，最终导致中线发育畸形和KV中纤毛数量的减少。

目录

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英文文摘

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绪论

第1章 全基因组水平研究斑马鱼SET基因及其表达谱分析

1.1引言

1.2材料与方法

1.2.1斑马鱼的喂养和胚胎收集

1.2.2质粒、菌株、酶、试剂(盒)

1.2.3斑马鱼总RNA的提取及RT-PCR

1.2.4斑马鱼SET基因的识别和克隆

1.2.5进化分析和直向同源基因预测

1.2.6外显子/内含子结构、染色体位置及synteny分析

1.2.7斑马鱼胚胎免疫荧光染色

1.2.8全胚胎原位杂交

1.3 结果

1.3.1 斑马鱼SET基因的识别与鉴定

1.3.2斑马鱼和人SET基因的进化分析和归类

1.3.3斑马鱼种系特异SET基因的起源

1.3.4人类种系特异SET基因的起源

1.3.5斑马鱼SET基因的表达谱分析

1.3.6母系高表达的SET基因

1.3.7体节/肌肉特异表达的SET基因

1.3.8神经系统特异表达的SET基因

1.3.9造血特异表达的SET基因

1.4 讨论

第2章一个潜在的H3K9me3组蛋白甲基转移酶在斑马鱼胚胎早期左右不对称建立中的作用机制研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1斑马鱼的喂养和胚胎收集

2.2.2质粒构建和探针制备

2.2.3全胚胎原位杂交

2.2.4 Morpholino和mRNA显微注射

2.2.5纤毛的免疫荧光及成像

2.2.6 Western Blot

2.3结果

2.3.1 setdb2的蛋白结构和胚胎发育阶段表达情况分析

2.3.2 setdb2 knockdown导致胚胎整体H3K9me3水平下降和心脏位置随机分布

2.3.3 setdb2 knockdown导致胚胎脏器和神经系统不对称性分布的打乱

2.3.4 setdb2对左右不对称基因的正常表达起关键调控作用

2.3.5 aetdb2 knockdown影响了KV中纤毛的发育

2.3.6 setdb2 knockdown影响胚胎中线和体节的发育

2.3.7寻找setdb2修饰的靶基因

2.3.8 setdb2 knockdown影响了组织者基因的表达

2.4讨论

结论和展望

参考文献

致谢

综述：斑马鱼的DNA甲基化

攻读博士期间发表及待发表文章目录

附录