卵黄高磷蛋白在壳聚糖膜上诱导钙离子矿化及作用机制研究

摘要

卵黄高磷蛋白是在鸡蛋蛋黄中发现的一种酸性糖蛋白。由于该蛋白质中含有大量丝氨酸，且大部分被磷酸化，这种结构赋予卵黄高磷蛋白很强的乳化性、抗氧化性和与金属离子结合的能力。本课题以卵黄高磷蛋白作为研究对象，探讨了它在体外诱导、调控Ca2+矿化的作用。在此基础上酶解蛋白得到卵黄高磷蛋白磷酸肽，研究了Ca2+与多肽的相互影响，并在细胞水平上开展了进一步研究。主要研究内容和实验结果如下:
　　(1)制备了壳聚糖及不同氧化石墨烯含量的壳聚糖复合膜，并采用扫描电镜、全反射红外光谱和溶胀率测试检测了复合膜的微观形貌、二级结构和溶胀性变化，将卵黄高磷蛋白作为诱导剂在复合膜上诱导模拟体液产生沉淀，沉淀用X射线衍射和扫描电镜观察。结果表明:氧化石墨烯会与壳聚糖发生共价结合，使壳聚糖膜表面变粗糙，横截面出现多层复合结构，溶胀性得到改善，复合膜溶胀率较壳聚糖膜降低27.90％。体外矿化结果表明:卵黄高磷蛋白能够促进Ca2+在矿化过程中从无定型磷酸钙向羟基磷灰石转变;氧化石墨烯/壳聚糖膜模拟体液中均产生了矿化沉淀。结论:氧化石墨烯可以改善壳聚糖膜性质，卵黄高磷蛋白和氧化石墨烯均能促进模拟体液沉淀产生。
　　(2)研究制备了壳聚糖和氧化石墨烯/壳聚糖复合膜，并采用CCK-8法、AnnexinⅤ/PI双染法和PI染色检测了蛋黄中提取的卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞在该复合膜基质上的生理活动的影响。结果表明:壳聚糖膜对细胞无毒性影响，并通过提高S期细胞所占比例从而使MC3T3-E1细胞活性提高了31.92％，同时，壳聚糖还能抑制细胞凋亡，凋亡率下降52.48％;而氧化石墨烯/壳聚糖膜组细胞凋亡率较高，氧化石墨烯含量越高，促进凋亡越明显，凋亡率在氧化石墨烯含量为2％时相比空白对照组上升11.31倍;在壳聚糖膜基质上，100μg/mL卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞促进增殖作用最显著，细胞活性提高81.59％,同时降低细胞的凋亡比例;蛋白浓度为500μg/mL时，细胞活性下降4.47％，促进细胞凋亡。结论分析，壳聚糖和低浓度卵黄高磷蛋白均能提高MC3T3-E1细胞活性。
　　(3)为了进一步研究卵黄高磷蛋白与钙离子相互作用的活性位点，针对卵黄高磷蛋白难以被水解的情况，联合不同酶解技术制备得到不同水解度的卵黄高磷蛋白磷酸肽，并研究了磷酸肽与Ca2+的结合能力。对比发现:采用处理剂和高温高压处理的卵黄高磷蛋白，其产物钙螯合率为68.57％，比卵黄高磷蛋白提高了62.9％;另一方面，未经预处理的卵黄高磷蛋白酶解10h后产物与钙结合能力最高，为48.69％;与钙结合后，蛋白和多肽的微观形貌均出现颗粒状物质。结论:采用非酶处理能提高卵黄高磷蛋白与钙离子的螯合能力。
　　(4)采用荧光、SEM、CD和FT-IR测定了不同处理方式下PV酶解产物与钙螯合后产物的微观结构、二级结构变化等。抗氧化活性能力评价显示，采用处理剂和高温高压处理后的PV的DPPH清除自由基能力最强，为52.98％。细胞实验显示，预处理后的PV能促进MC3T3-E1细胞的增殖，抑制其凋亡，上调细胞相关分化基因表达。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 生物矿化

1．1 生物矿化的分类

1．2 仿生矿化调控过程中的关键因素

2 卵黄高磷蛋白对生物矿化的影响

2．1 多f9黄高磷蛋白的结构和分离纯化方法

2．2 PV调控生物矿化的研究

2．3 PV磷酸肽制备及钙离子螯合研究

3 选题意义及主要研究内容

3．1 本课题研究意义

3．2 本课题主要研究内容

第二章 壳聚糖及其复合膜基质上PV对体外矿化的影响

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 制备的PV的纯度分析

2．2 PV的分子量分析

2．3 CS(复合)膜的官能团变化

2．4 CS(复合)膜的微观形貌分析

2．5 CS(复合)膜的溶胀率变化

2．6 CS(复合)膜的晶型分析

2．7 CS(复合)膜的微观形貌分析

3 本章小结

第三章 PV对CS膜基质上的MC3T3-E1细胞增殖的影响

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．2 CS及其复合膜对MC3T3-E1细胞凋亡的影响

2．3 CS及其复合膜对MC3T3-E1细胞周期的影响

2．5 PV对膜上MC3T3-E1细胞凋亡的影响

3 本章小结

第四章 预处理卵黄高磷蛋白及其酶解产物对金属离子螯合能力的研究

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 预处理后PV的分子量分布

2．2 预处理后PV的水解度和钙螯合率

2．3 同酶解时间对PV水解度和钙螯合的影响

2．4 不同酶解时间的PV的分子量分布

2．5 酶解时间对Pre-PV水解度和钙螯合的影响

2．6 不同酶解时间的Pre-PV的分子量分布

2．7 酶与底物比例对酶解PV水解度和钙螯合的影响

2．8 不同酶与底物比例对酶解PV的分子量分布

2．9 酶与底物比例对酶解Pre-PV的水解度和钙螯合的影响

2．10 不同酶与底物比例对酶解预处理PV的分子量分布

3 本章小结

第五章 PV磷酸肽的结构性质及对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 PV水解物与钙螯合前后的荧光光谱

2．2 PV水解物与钙螯合后官能团变化

2．3 PV水解物与钙螯合后的微观形貌分析

2．4 水解前后PV二级结构的变化

2．5 PV水解物的抗氧化能力

2．6 PV及其水解物对MC3T3-E1细胞增殖的影响

2．7 PV水解物对MC3T3-E1细胞凋亡的影响

2．8 不同处理条件的酶解产物对MC3T3-E1成骨细胞骨形成相关基因BMP-2、OPG和RANKL mRNA表达的影响

3 本章小结

第六章 结论与展望

1 结论

2 实验创新点

3 展望

参考文献

附录

致谢