汉坦病毒基因分型生物芯片方法研究

摘要

该实验综合运用DNA在片延伸、固相PCR、分子杂交、酶学信号放大等生物芯片技术,建立了一种用DNA芯片快速检测汉坦病毒并进行基因分型的方法,探讨其临床应用价值.实验利用等位基因特异性PCR的原理,通过Genebank搜索所有汉坦病毒基因组片段,比对分析各亚型的分型点,设计出各亚型的分型引物,在引物的5'端的磷酸基团上进行(CH2)6-S-S-(CH2)6-Poly(T)10-修饰,利用二硫键将分型引物固定于芯片表面,采用固相PCR在片延伸病毒特异DNA片段,同时采用半巢式PCR以提高扩增效率.只有引物与模板完全配对时,PCR才能够正常进行,DNA在片延伸过程中,通过生物素修饰的dUTP将生物素掺入DNA双链,利用亲和素交联的碱性磷酸酶对PCR结果进行芯片酶学检测.检测结果表明,该方法能够在芯片上检测并区分汉坦病毒S基因的多个型别,灵敏度可达到0.5 ng/μL.用此DNA芯片系统检测临床实际病毒样品,检测结果与用血清学方法检测得到的已知型别结果完全吻合.

目录

前言

材料与方法

1 S基因cDNA文库的建立

2液相半巢式PCR

3基于DNA芯片的分型杂交检测

4固相PCR及芯片酶学检测

5病毒样品的核酸抽提与逆转录

结果

1 PCR扩增结果

2杂交检测

3固相PCR检测

4实际汉坦病毒样品的固相酶学检测结果

讨论

参考文献

生物芯片研究进展及展望

参考文献

致谢