汉坦病毒基因分型及其核苷酸序列特征分析

摘要

目的：研究黑龙江省、吉林省和内蒙古自治区野外优势鼠种黑线姬鼠和大林姬鼠中汉坦病毒的基因型,建立一种扩增全S片段的方法,用以明确基因亚型及其进化,阐明汉坦病毒的遗传特征,为该地理区域肾综合征出血热的预防控制提供科学依据；研究沈阳一起实验动物Wistar大鼠感染汉坦病毒的基因类型以及当地褐家鼠和肾综合征出血热病人中汉坦病毒的基因型别及其特征,建立扩增全M片段的方法,为分析汉坦病毒与宿主的关系提供有力证据。 方法：捕获鼠类啮齿动物,鉴定鼠种,取鼠肺液氮中保存,用间接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原及汉坦病毒IgM和IgG抗体,提取阳性鼠肺中病毒RNA,采用RT-PCR的方法扩增汉坦病毒S,M片段序列,对序列进行系统发生学分析,同时采用Vero-E6细胞分离病毒。 结果：黑龙江、吉林和内蒙古自治区三地黑线姬鼠和大林姬鼠共扩增出11份阳性标本,用全S片段构建系统发生树表明其携带汉坦病毒汉滩型的两个亚型,HTNV6和HTNV7。建立从鼠肺直接扩增全s片段的RT-PCR方法。从黑线姬鼠中分离到一株汉坦病毒HAal.74。沈阳三个单位实验用大白鼠(Wistar鼠)共计57只,其中抗原阳性标本26份,流行性出血热病人血清27份,褐家鼠阳性标本15份,通过部分S,M片段以及全S,M序列构建系统发生树分析表明沈阳市主要是家鼠型疫区,病毒主要存在汉城型S1和S3这两个亚型。建立从鼠肺直接扩增全M片段的方法。从实验用大白鼠(Wistar鼠)分离到一株汉坦病毒Wistar41。 结论：东北地区黑线姬鼠和大林姬鼠主要携带汉滩型病毒,存在两个亚型HTNV6、7。沈阳市主要为家鼠型肾综合征出血热疫区,汉城病毒有两个亚型S1、S3。

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论文说明：文中使用英文缩写表

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前言

1.文献综述 姬鼠类啮齿动物及其携带汉坦病毒的相互关系

一.可携带汉坦病毒的姬鼠属啮齿动物的地理分布

1.黑线姬鼠类群

2.小林姬鼠类群

二.姬鼠属相关汉坦病毒的遗传特征

三.姬鼠属相关汉坦病毒的进化演化规律

2.材料和方法

2.1实验材料

2.1.1样本来源

2.1.2毒株

2.1.3细胞

2.1.4实验中所用试剂

2.1.5实验所用仪器

2.1.6实验所用引物

2.1.7构建系统发生树分析所选取毒株

2.2实验方法

2.2.1标本采集

2.2.2用间接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原

2.2.3用直接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原

2.2.4用间接免疫荧光法检测血清中抗汉坦病毒IgM抗体及效价

2.2.5用间接免疫荧光法检测血清中抗汉坦病毒IgG抗体及效价

2.2.6汉坦病毒抗原抗体阳性的判定标准

2.2.7总RNA的提取

2.2.8 RT-PCR及Nested-PCR

2.2.9电泳检测

2.3.10 PCR产物纯化回收

2.3.11 PCR产物的克隆及测序

2.3.12核苷酸序列分析

2.3.13汉坦病毒的分离

3.结果

3.1汉滩型汉坦病毒基因分型

3.1.1鼠肺标本免疫荧光检测结果

3.1.2 FS引物设计

3.1.3 RT-PCR检测结果

3.1.4测序结果及序列比对

3.1.5系统发生分析结果

3.1.6 Vero E6细胞分离汉滩病毒

3.2汉城型汉坦病毒基因分型

3.2.1 Wistar鼠汉坦病毒抗原检测结果

3.2.2汉坦病毒抗体检测结果

3.2.3 RT-PCR检测结果

3.2.4系统发生学分析

3.2.5全M序列扩增结果

3.2.6 Wistar鼠携带汉城型汉坦病毒的分离

4.讨论

5.结论

参考文献

致谢

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