[Ca]和ROS在氟化钠致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的关系研究

摘要

地方性氟中毒是一种严重危害人体健康的全身性疾病，过量摄入氟除引起氟斑牙和氟骨症外，还可造成全身软组织的广泛损伤。大量研究结果表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在氟的毒性作用机制中起重要作用。实验研究也发现慢性氟中毒可引起细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]I）的升高，[Ca2+]I异常升高可引起细胞的急慢性损伤和死亡。 [Ca2+]I与ROS之间有着错综复杂的关系，它们是紧密偶联的。ROS可引起细胞内贮存Ca2+的细胞器如内质网、线粒体膜和胞膜的破坏，导致胞内Ca2+重分布和胞外Ca2+的内流，从而引起细胞内持续的Ca2+水平升高。ROS和Ca2+都可诱发线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)开放，MPTP开放一方面使ROS大量升高，另一方面也使线粒体外膜破裂导致膜间腔Ca2+释放，而胞浆Ca2+的大量升高作为第二信使，启动多条信号转导途径，亦会使ROS升高。 ROS的产生堆积和胞内Ca2+水平的升高都是细胞损伤中的重要事件，且两者相互促进，在细胞损伤中发挥重要作用，因而ROS与[Ca2+]I的关系值得重视，但目前在慢性氟中毒引起的细胞损伤中ROS和Ca2+水平升高，二者哪个是始动环节哪个是继发环节？二者是因果联系还是平行关系目前尚未见报道。 因此，本研究拟用不同浓度的氟化钠（NaF）对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞进行染毒，观察NaF对SH-SY5Y细胞[Ca2+]I、ROS和培养液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenate，LDH）的影响，以及加入胞内钙离子螯合剂（1,2-bis-(2-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxy-methyl) ester，BAPTA-AM）、胞外钙离子螯合剂乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol-bis-(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid，EGTA）、抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨（N-acetyl-L-cysteine，NAC）后，细胞[Ca2+]I、ROS水平和培养液中LDH水平的变化情况，从而探讨[Ca2+]I和ROS在NaF致SH-SY5Y细胞损伤中的关系，为进一步研究氟的毒性作用机制奠定基础。 本研究主要由以下两部分组成 第一部分、NaF对SH-SY5Y细胞毒性、[Ca2+]I和ROS水平的影响 目的：利用体外实验方法探讨NaF对SH-SY5Y细胞的细胞毒性、[Ca2+]I和ROS水平的影响，找出[Ca2+]I和ROS升高的峰值时间点。方法：SH-SY5Y细胞暴露于20、40、80μg/ml NaF，以荧光探针4-(6-Acetoxymethoxy-2,7-dichloro-3-oxo-9-xanthenyl)-4'-methyl-2,2'(ethylenedioxy)dianiline-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester（Fluo-3/AM）负载，通过激光共聚焦显微技术（Laser scanning confocal microscope，LSCM）连续监测[Ca2+]I水平的变化；用比色法检测细胞培养液中LDH水平和流式细胞术（flow cytometryl，FCM）检测胞内ROS的变化。选择适宜剂量用流式细胞术检测在不同染毒时间点SH-SY5Y细胞胞内Ca2+、ROS的变化。结果：40、80μg/mlNaF作用SH-SY5Y细胞24h后细胞培养液中LDH、细胞内ROS水平均显著高于对照组（P<0.05，P<0.05）。对照组与20μg/ml NaF剂量组[Ca2+]I在2h内没有明显变化；在40μg/mlNaF剂量组，氟作用5000s 左右时[Ca2+]I缓慢上升，之后上升幅度增大，约6000s时达到高峰，持续至10000s，然后开始下降；在80μg/ml NaF剂量组，一开始[Ca2+]I就急剧上升，约2500s达到高峰，然后迅速下降。40μg/ml NaF剂量组[Ca2+]I在不同时间点与对照组相比均显著升高（P<0.05）；细胞内ROS水平除3h外其他各时间点与对照组相比均显著升高（P<0.05）；[Ca2+]I、ROS达到峰值的时间点分别为3h和12h。结论：NaF可诱导SH-SY5Y细胞膜的损伤、引起[Ca2+]I和ROS水平的升高，[Ca2+]I和ROS水平升高的峰值时间点分别为3h和12h。 第二部分、[Ca2+]I和ROS在NaF致SH-SY5Y细胞损伤中的关系研究 目的：探讨[Ca2+]I和ROS在NaF致SH-SY5Y细胞损伤中的关系。方法：用胞内钙离子螯合剂（BAPTA-AM）、胞外钙离子螯合剂（EGTA）、抗氧化剂（NAC）分别与40μg/mlNaF联合培养，3、12、24 h后分别检测细胞[Ca2+]I、ROS和细胞培养液中LDH水平的变化情况。结果：与40μg/ml NaF单独染毒相比，在3h时BAPTA-AM可使[Ca2+]I水平下降（P<0.05），NAC与EGTA对[Ca2+]I水平没有明显影响（P>0.05）；在12h NAC与BAPTA-AM分别使ROS水平明显下降（P<0.05），而EGTA对ROS水平没有明显影响（P>0.05）；在24hNAC与BAPTA-AM可使细胞培养液中LDH水平明显下降（P<0.05），EGTA对LDH水平没有明显影响（P>0.05）。结论：NaF诱导SH-SY5Y细胞损伤的机制可能是通过胞内钙库的释放提高[Ca2+]I水平，升高的[Ca2+]I促使ROS的产生，二者共同对细胞产生毒性，导致细胞培养液LDH水平升高。