H+感受器在胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加中的作用及机制

摘要

文章从以下两部分就H+感受器在胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加中的作用及机制进行了综述。
　　第一部分 ASICs和TRPV1介导胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加
　　目的:探讨ASICs和TRPV1在胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加中的作用。
　　方法:运用原代培养的大鼠心室肌细胞,采用钙离子成像技术,观察胞外酸化诱导的心室肌细胞[Ca2+]i变化。
　　结果:
　　1.胞外pH6.0和pH5.0诱导心室肌细胞[Ca2+]i增加,ASICs非特异性阻断药阿米洛利(300μM)和ASIC1特异性阻断药PcTx1(10 nM)对该增加均有抑制作用, pH6.0时抑制率为分别为48.86±6.92％和51.25±4.94％;pH5.0时抑制率分别为50.07±5.70％和53.51±3.31％。
　　2.pH5.0诱导的心室肌细胞[Ca2+]i增加能被TRPV1非特异性阻断药钌红(10μM)部分阻断,其抑制率为56.16±6.22％。
　　3.联合运用阿米洛利(300μM)和钌红(10μM)明显阻断pH5.0诱导的心室肌细胞[Ca2+]i增加,抑制率为82.61±4.18％。
　　结论:胞外酸化(pH6.0和pH5.0)诱导培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加,ASICs和TRPV1通过外钙内流途径介导该增加。
　　第二部分卵巢癌G蛋白偶联受体1(OGR1)介导胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加
　　目的:探讨大鼠心肌组织和心室肌细胞上是否有H+敏感的G蛋白偶联受体(包括:OGR1、G2A、GPR4和TDAG8四个亚型,其中OGR1和G2A主要与Gq偶联, GPR4和TDAG8主要与Gs偶联)的表达,以及OGR1在胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加中的作用及机制。
　　方法:应用原代培养的大鼠心室肌细胞,采用RT-PCR、western blotting和免疫荧光等技术,观察OGR1在大鼠心肌组织和心室肌细胞的表达情况。采用钙离子成像技术,观察OGR1介导的胞外酸化诱导的心室肌细胞[Ca2+]i变化。
　　结果:
　　1.大鼠心肌组织和心室肌细胞表达H+敏感G蛋白偶联受体。
　　(1) RT-PCR结果表明,在心室肌细胞中存在 H+敏感的的G蛋白偶联受体OGR1、TDAG8和GPR4 mRNA的表达,但是没有G2A。
　　(2)Western blotting结果进一步证明在心室肌细胞上有OGR1蛋白的表达。
　　(3)用心肌标记物进行特异性标记,免疫荧光结果显示大鼠心肌组织和心室肌细胞均有OGR1蛋白的表达。
　　2.OGR1通过内钙释放介导胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加。
　　(1)去除外液中的Ca2+,并利用EGTA进一步螯合外液中Ca2+后,胞外pH5.0能诱导出心室肌细胞[Ca2+]i增加。
　　(2)在去除外钙和pH5.0情况下,胞内钙库耗竭剂TG(3μM)完全抑制心室肌细胞[Ca2+]i增加,抑制率达93.30±0.01％。
　　(3)在去除外钙和pH5.0情况下,磷脂酶C抑制剂U73122(4μM)和IP3受体拮抗剂2-APB(200μM)明显抑制心室肌细胞[Ca2+]i增加,抑制率分别为54.45±0.16％和61.79±0.19％。
　　(4)在去除外钙和pH5.0情况下,OGR1非特异性拮抗剂Cu2+(400μM)抑制心室肌细胞[Ca2+]i增加,抑制率为38.87±0.15％。
　　结论:
　　1.大鼠心肌组织和培养的心室肌细胞上均有 H+敏感的G蛋白偶联受体 OGR1 mRNA和蛋白的表达。
　　2.OGR1通过内钙释放的途径介导胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加。

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声明

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

前 言

参考文献

第一部分 ASICs和TRPV1介导胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

1. 材料和方法

1.1 实验动物

1.2 药品与试剂

1.3 实验仪器

1.4 溶液的配置

1.5 大鼠心室肌细胞培养

1.6 钙离子荧光成像测定

1.7 统计分析

2. 结果

2.1 胞外酸化诱导培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

2.2 阻断ASICs部分抑制胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

2.3 阻断TRPV1部分抑制胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

2.4 双重阻断ASICs和TRPV1显著抑制胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

3. 讨论

参考文献

小 结

第二部分 卵巢癌G蛋白偶联受体1（OGR1）介导胞外酸化诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

1. 材料和方法

1.1 实验动物（同第一部分）

1.3 实验仪器

1.4 溶液的配置

1.4.1 细胞培养用溶液的配制（同第一部分） 1.4.2 钙离子成像用溶液的配置

1.5 大鼠心室肌细胞培养方法（同第一部分） 1.6 钙离子荧光成像测定（同第一部分）

1.7 RT-PCR

1.8 Western Blotting

1.9 免疫荧光

1.10 统计分析

2. 结果

2.1 无钙酸外液诱导培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

2.2 无钙酸外液诱导培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i的增加依赖于胞内钙库

2.3 PLC-IP3信号通路参与无钙酸外液诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

2.4 培养大鼠心室肌细胞表达质子敏感的G蛋白偶联受体OGR1

2.5 抑制OGR1明显阻断无钙酸外液诱导的培养大鼠心室肌细胞[Ca2+]i增加

3. 讨 论

参考文献

小 结

全文总结

本文创新点

1. 通过钙离子成像技术，证明ASICs和TRPV1在心室肌细胞有功能性的表达。

2. 证明心室肌细胞上有OGR1 mRNA和蛋白的表达，OGR1通过内钙释放的机制参与胞外酸化诱导的心室肌细胞[Ca2+]i增加。

展 望

攻读硕士学位期间待发表的论文

攻读硕士学位期间发表的会议论文摘要

攻读硕士学位期间参与的课题

综 述

1. 前言

2. 生物作用和信号通路

3. H+敏感的分子机制

4. 溶血脂质的双重效应模式

5. 潜在的生理学和病理生理学意义

6．结论

参考文献

致谢