香菇多糖的结构与抗肿瘤活性的关系研究

摘要

香菇多糖历来被人们当作一种免疫调节剂,已在临床上用于癌症的辅助治疗;但是近年来的研究表明其还有直接杀死肿瘤细胞的作用。无论哪种作用方式,已有的研究成果均表明其抗肿瘤作用的发挥与结构密切相关,但目前就其结构和抗肿瘤活性的关系尚有争论。本论文以香菇子实体为原料先后采用水提醇沉和稀碱浸提的方法提取得到香菇粗多糖,经进一步的脱色、除蛋白和分级分离纯化得到五种精制多糖组分LST1、LST2、LJT1、LJT2和LJT3,综合采用化学分析、波谱分析和现代仪器分析技术,通过对香菇多糖一级化学结构、糖链高级构象的鉴定和体内外抗肿瘤活性的考察,深入探讨了其结构与抗肿瘤活性之间的内在联系,为进一步的定量构效关系研究和计算机模拟糖链构象奠定基础,同时为后继的抗肿瘤作用分子机制研究提供理论和物质基础。
　　第一部分，香菇多糖的提取、分离和纯化
　　以浙江庆元香菇子实体为原料,分别采用水提醇沉和碱提醇沉的方法,并依次进行脱色和超滤分级分离后得到五种不同均一组分的精制香菇多糖LST1,LST2,LJT1,LJT2和LJT3,通过测定其糖含量和紫外扫描鉴定样品纯度,又经分子量测定及比旋光度检测分析其理化性质。HPGPC法测定其相对分子质量分别为524kDa、65.5kDa、697kDa、200kDa、98.4kDa;苯酚-硫酸法检测其糖含量依次为97.94％、100.16%、101.37%、107.29%、103.99%;紫外UV扫描显示基本不含核酸和蛋白质;其比旋光度[α]D20测定分别为22.6、-10.4、10.6、3.4和-2.6。各组分多糖性状良好,纯度较高,符合后续实验要求。
　　第二部分，香菇多糖的一级结构研究
　　采用完全酸水解确定各组分香菇多糖的单糖组成,以高碘酸氧化和Smith降解分析其所含糖残基类型及比例,通过甲基化分析确证其糖残基比例;红外光谱扫描表征各组分精制多糖的特征吸收峰和糖残基构型,NMR分析其糖残基类型、连接顺序及取代位点,并与化学分析结果相互佐证。实验结果显示:LST1、LST2、LJT1、LJT2和LJT3均由葡萄糖组成,化学分析表明其分别包含4种类型的糖残基,所占比例(1-6和末端:1-3和1-3-6)依次约为1:1.6,1:1,1:3,1:2和1:2;IR扫描表明其具有多糖的特征吸收峰,且为β-D-吡喃糖结构;NMR检测可进一步推测各组分多糖均是在C6上分支的β-(1→3)-D-吡喃葡聚糖主链结构,其基本组成单元中具有相似结构。
　　第三部分，香菇多糖的糖链构象研究
　　以LST1为例,将其用NaOH进行解螺旋的变性处理,继而以蒸馏水透析使其螺旋结构复性,冻干后得到复性多糖,命名为LST1s。采用刚果红实验,通过对比不同浓度NaOH溶液中香菇多糖LST1、LST2、LJT1、LJT2和LJT3分别与刚果红形成的复合物最大吸收波长λmax的变化,推测五种组分多糖糖链的螺旋构象,另外考察了变性前后LST1以及LST1s空间结构的变化;通过AFM观察五种组分香菇多糖、变性后的LST1以及LST1s的表观形态分布并推测其空间构象;XRD检测各组分精制多糖糖链的规则排布,考察其晶体学信息。实验结果初步验证天然的香菇多糖结构中含有三螺旋构象,而LST1s则可能是单股螺旋结构;天然的香菇多糖在水溶液中的形态呈线性支链状,而变性后的LST1为圆球状,LST1s则还原为线性结构,这种形态结构的变化显示了香菇多糖经高浓度NaOH变性处理后依然可以恢复螺旋构象;天然香菇多糖的糖链高度与XRD所测得的晶体学参数(结晶大小)基本吻合,均在1.7nm左右,可进一步证实各组分多糖中存在三螺旋的空间构象,而LST1s的糖链高度标定结合刚果红实验结果推测LST1s主要以单螺旋构象存在。
　　第四部分，香菇多糖的体内外抗肿瘤活性研究
　　采用MTT比色法考察天然香菇多糖LST1、LST2、LJT1、LJT2和LJT3分别对不同肿瘤细胞体外增殖的抑制作用,以及LST1s对H22体外增殖的抑制作用;选取LST1进行体内抗肿瘤实验,进一步研究香菇多糖对S180体内增殖的抑制作用和其对宿主免疫系统的影响。实验结果表明各组分香菇多糖对H22、S180和HepG2肿瘤细胞均具有一定的抑制作用,且表现出良好的量效依赖关系,同时大分子量多糖抑瘤率要高于小分子量多糖;但是对K562肿瘤细胞并不敏感,表明香菇多糖的抑瘤作用对于不同肿瘤细胞具有一定的选择性。LST1s的体外抗肿瘤实验初步表明具有单股螺旋结构的香菇多糖同样具有良好的抗肿瘤作用。LST1的体内抗肿瘤实验结果显示低、中、高三个剂量给药组抑瘤率分别为54.03%、61.68%和53.52%,脾指数和免疫细胞数目的增加表明LST1可以刺激宿主免疫组织的增殖和分化,具有调节免疫的作用;结合体外实验结果可推断香菇多糖可能具有直接杀死肿瘤细胞和免疫调节的双重抗肿瘤作用,并且较少出现临床常用化疗药物的副作用。
　　第五部分，香菇多糖的结构与抗肿瘤活性的关系
　　结合论文的研究结果和文献报道,从主链、分子量、分支度和分支长度、螺旋结构和水溶性五个方面,对香菇多糖的结构和抗肿瘤活性之间的内在联系作出深入探讨。研究总结出天然香菇多糖绝大多数具有β-(1→3)-D-吡喃葡萄糖的基本骨架,为其发挥抗肿瘤活性的前提;同一提取方法来源的香菇多糖中,大分子量多糖的抗肿瘤作用强于小分子量多糖;分支侧链的存在才能保证糖链螺旋结构的稳定性,而分支度又从另一方面解释了大分子量多糖具有较高抗肿瘤效果的现象,使分支度成为衡量抗肿瘤效果的一个重要因素;在天然香菇多糖中单螺旋结构是香菇多糖发挥生物学活性的基础,三螺旋可能为辅助作用,使香菇多糖在体内更易被受体识别,激活免疫系统,联合其直接抑制肿瘤细胞的作用,从而可发挥双重抗肿瘤效果;另外香菇多糖在水溶液中的溶解性也是影响其抗肿瘤作用的一个因素。构效关系的阐述为下一步分子作用机制的研究打下了理论基础。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 香菇多糖的提取、分离和纯化

1. 香菇多糖的提取、纯化和分级分离

2. 香菇多糖的纯度鉴定及理化性质考察

3. 讨论与结论

第二部分 香菇多糖的一级结构研究

1. 香菇多糖结构的化学分析

2. 香菇多糖结构的波谱分析

3. 讨论与结论

第三部分 香菇多糖的糖链构象研究

1. 三螺旋结构的初步考察

2. 糖链高级结构的表观形态考察

3. 糖链构象的晶体学考察

4. 讨论与结论

第四部分 香菇多糖的体内外抗肿瘤活性研究

1. 香菇多糖的体外抗肿瘤活性研究

2. 单链多糖LST1s体外抑制H22肿瘤细胞增殖实验

3. 香菇多糖LST1的体内抗肿瘤活性研究

4. 讨论与结论

第五部分 香菇多糖的结构与抗肿瘤活性的关系

1. 主链与抗肿瘤活性的关系

2. 分子量与抗肿瘤活性的关系

3. 分支度和分支长度与抗肿瘤活性的关系

4. 螺旋结构与抗肿瘤活性的关系

5. 水溶性与抗肿瘤活性的关系

研究总结

参考文献

综述

致谢

附录1攻读学位期间拟发表论文目录

附录2