一种具有抗肿瘤活性的三螺旋香菇多糖及其制法和用途

摘要

本发明涉及一种三螺旋香菇多糖，主链为β－(1→3)－D－葡聚糖，含20－30％(1→6)键接的葡萄糖侧基，它在水中呈三螺旋链，重均分子量为20－200万。其制法是，将干燥的香菇子实体剪碎，依次用索氏提取去除脂肪，然后浸泡在生理盐水中，离心；残渣在100－130℃下提取，离心；残渣用NaOH/NaBH4的水溶液提取；提取液中加入醋酸中和；上清液脱色，除去游离的蛋白质；然后透析，浓缩，冷冻干燥得三螺旋香菇多糖。所得三螺旋香菇多糖具有较高的抗肿瘤活性，可用于制备提高免疫机能和抗肿瘤的药物或保健品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性得三螺旋香菇多糖及其制备方法和用途。它属于高分子物理领域，也属于生物学领域。

背景技术

60年代初，Chihara发现从香菇子实体中提取出的多糖具有抗肿瘤活性(Nature，1969，222，687；1970，225，943；Cancer Res.，1970，30，2776.)，此后多糖研究受到极大重视。80年代以来的研究表明，真菌多糖是一种免疫调节剂，它能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞素，从而提高人体的免疫机能，对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、肺炎等都具有一定的疗效，而且对正常细胞没有毒副作用(Intern.J.Orient.Med.17，57，1992)。香菇属于真菌，是我国的特产资源，长期用于中药配方，在传统医学上被用作灵丹妙药。但将香菇子实体直接用做中药，疗效受到制约。因为香菇中含有多种多糖，包括杂多糖、α-葡聚糖、β-葡聚糖，而且随提取条件而变化，部分多糖是不能靠普通中药的煎熬方法提取出来。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的三螺旋香菇多糖及其制备方法和用途，所制得的三螺旋香菇多糖具有较高的抗肿瘤活性，且制备方法简单易行、成本较低廉。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种具有抗肿瘤活性的三螺旋香菇多糖，主链为β-(1→3)-D-葡聚糖，含20～30％(1→6)键接的葡萄糖侧基，它在水溶液中呈三螺旋链构象，其持续长度q为80～120nm；单位围长摩尔质量M_L为2000～2300nm^-1；螺距h为0.30～0.32nm；均方根旋转半径<s²>_z^1/2与重均分子量M_w之间的依赖关系：<s²>_z^1/2＝KM_w^α方程中的指数α为0.8～1；重均分子量为20万～200万。

在本发明的优选方案中，上述三螺旋香菇多糖，还含有0～20％结合蛋白质。

本发明还提供了上述三螺旋香菇多糖的制备方法，将干燥的香菇子实体(Lentinusedodes)剪碎，依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪，然后浸泡在生理盐水中，离心；残渣在100～130℃下提取，离心，收集残渣；残渣用0.3～6wt％NaOH/0.01～0.05wt％NaBH₄的水溶液在常温下提取，离心得提取液；于提取液中加入醋酸中和至pH6～8，收集上清液；上清液用H₂O₂脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质；然后分别用清水和二次蒸馏水透析，浓缩，冷冻干燥得三螺旋香菇多糖。

本发明利用生物技术，从不同菌种培养得到的香菇子实体中提取分离出具有明显抗肿瘤活性和免疫机能的香菇三螺旋多糖，同时弄清楚它的一级和二级结构及其与抗肿瘤等生物活性之间的关系。所用方法简单易行、成本较低廉。本发明利用高分子物理理论和方法研究香菇三螺旋多糖在溶液中的链构象；所制得的三螺旋香菇多糖具有较高的抗肿瘤活性，可用于制备提高免疫机能和抗肿瘤的药物或保健品。

由对植入Sarcoma 180肿瘤的小鼠进行体内腹腔注射实验的生物活性结果表明，本发明香菇三螺旋多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用，甚至超过化学药物5-Fu的效果(50％)。当三螺旋链被破坏以后，它基本不显示抗肿瘤活性，表明链刚性在抗肿瘤活性中起了很重要的作用。尤其，适量结合蛋白质存在三螺旋多糖中有利于抗肿瘤活性提高。体外胃癌细胞和宫颈癌细胞Hela的生长和增殖的试验结果表明香菇多糖对肿瘤细胞有选择性，即对胃癌细胞有显著抑制作用，而对Hela细胞基本无抑制作用。同时对香菇三螺旋多进行人体急性白血病毒细胞(HL-60)和人体乳腺癌细胞(MCF-7)的抗增殖实验结果表明其对增殖有显著的抑制效果，而不会破坏正常猴肾细胞的增殖。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明：

实施例1

购买市售的湖北随州产香菇子实体，将香菇子实体碎片依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各8小时。然后用0.9％NaCl水溶液在室温下提取三次：浸泡在0.9％NaCl水溶液中过夜，离心，收集残渣。残渣用热水(100℃)提取三次，每次半小时，离心，收集残渣；残渣依次用0.4％NaOH/0.02％NaBH₄，0.8％NaOH/0.02％NaBH₄和5％NaOH/0.05％NaBH₄水溶液于室温下提取一次，离心，收集上清液。用1M HOAc水溶液于室温下中和至pH＝7，离心，收集上清液。上清液浓缩后，均用30％H₂O₂脱色至浅黄色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次以上。然后，分别用清水和二次蒸馏水经再生纤维素膜透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得三螺旋多糖纯品(L-FV-IB)。用粘度计、光散射及其与尺寸排除色谱联用仪检测各多糖试样的特性粘数、重均分子量和均方旋转半径，按照高分子溶液理论和方法及计算机模拟，计算出表征高分子在溶液中链的分子参数。由此得出香菇多糖在水溶液中呈现三螺旋链构象，而在DMSO中呈单股线团链。另外将香菇多糖溶于DMSO中，使其三螺旋链破坏成单链，再加入沉淀剂丙酮使产物沉淀分离出，然后用丙酮充分洗涤除去DMSO、真空干燥得到单链香菇多糖。将多糖L-FV-IB溶解于水中，经超声波降解成不同分子量级分，再以丙酮为沉淀剂，将各级分分离成分子量分布窄的级分，最后冷冻干燥得到不同分子量及分布窄的香菇多糖级分(L-FV-IB21，L-FV-IB22，L-FV-IB31，L-FV-IB41，L-FV-IB32，L-FV-IB52，L-FV-IB62，L-FV-IB43，L-FV-IB73)。试样L-FV-IB21和L-FV-IB31溶于DMSO使三螺旋破坏成单链，然后用以丙酮为沉淀剂将其沉淀分离出来，再用丙酮充分洗涤除去DMSO，真空干燥，由此制备得到单链试样L-FV-IB21D和L-FV-IB31D。

用酚磺酸法测定多糖中碳水化合物的含量，用红外、气相色谱确定其化学组成和结构。用粘度计、光散射及光散射-尺寸排除色谱联用仪测定其特性粘数([η])和重均分子量(M_w)。香菇多糖(L-FV-IB)及其各级分在0.9％NaCl水溶液和DMSO中的分子量、特性粘数和构象参数(q，持续长度；M_L，单位围长摩尔质量；h，螺距)详见附表1。由此得出，L-FV-IB在水溶液中的分子量是其在DMSO中的三倍，而且由高分子溶液理论和计算机模拟得到的构象参数符合三螺旋链的模型参数。由此表明，L-FV-IB在水溶液中呈现三螺旋链构象，而在DMSO中呈单股线团链。

附表1.湖北随州产香菇子实体三螺旋多糖在0.9％NaCl水溶液和DMSO中25℃时的特性粘数[η]、分子量M_w和构象参数。

         重均分子量× 特性粘数    试样              10^-5    (mL/g)        单位围长持续长度         螺距n        摩尔质量q(nm)            (nm)        M_L(nm^-1)  L-FV-IB      8.8     508               2.8^a   63^a  L-FV-IB21    18.4    1630  L-FV-IB22    16.5    1480  L-FV-IB31    14.9    1170  L-FV-IB41    11.4    950  L-FV-IB32    9.79    725  L-FV-IB52    5.71    405  L-FV-IB62    5.27    336  L-FV-IB43    4.2     -  L-FV-IB73    3.57    202 100    2200     0.31

a：在DMSO中的值

香菇三螺旋多糖L-FV-IB及单链多糖L-FV-IBD系列试样对植入BALB/c小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤抑制率的结果见附表2。

附表2.市售湖北遂州产香菇子实体三螺旋多糖抗BALB/c小鼠体内Sarcoma 180肿瘤的活性试验结果。

    试样 重均分子量 ×10^-5  构象剂量(毫克/千克×天)抑制率(％)体重增长率(％)完全抑制率 5-Fu    60×8  50.5  12.6  0/10 L-FV-IB12    21.6三螺旋    20×8  23.0  36.1  0/10    60×8  34.6  38.3  0/10 L-FV-IB21    18.4三螺旋    20×8  31.2  33.7  0/10    60×8  36.3  31.9  0/10 L-FV-IB31    14.9三螺旋    20×8  28.6  42.2  0/10    60×8  49.5  42.4  0/10 L-FV-IB21D    5.59单股无规线团    20×8  12.8  33.2  0/10    60×8  16.8  33.4  0/10 L-FV-IB31D    4.37单股无规线团    20×8  8.1  41.1  0/10    60×8  12.3  40.1  0/10

注：具有三螺旋链的香菇β-葡聚糖当分子量相对低时如L-FVIB31，它显示明显抗S-180肿瘤活性。但当三螺旋破坏成单股链后其抗肿瘤活性基本消失，如L-FV-IB21D和L-FV-IB31D。

显然，该多糖对植入BALB/c小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤抑制率具有分子量和剂量依赖性。高剂量时显示较高抗肿瘤活性，分子量为14.9×10⁵的级分L-FV-IB31对S-180肿瘤细胞显示出高达49.5％的抑制率，接近5-Fu的值(50％)，且与对照组差别非常显著。而三螺旋被破坏成单股链后，其抗肿瘤活性基本消失，如试样L-FV-IB21D和L-FV-IB31D。体外活性实验也表明，香菇子实体多糖对Sarcoma 180肿瘤细胞的增殖有显著的抑制效果，而且具有剂量和分子量依赖性(附表3)。分子量相对小的湖北遂州产香菇多糖试样对S-180肿瘤细胞和胃癌细胞的抑制作用相对较高，而分子量为5.71×10⁵0的级分L-FV-IB52表现出对S-180肿瘤细胞和胃癌细胞最强的抑制作用，其抑制率分别高达45.3％和56.2％。同时该多糖对抗肿瘤细胞还具有选择性，如它对宫颈癌细胞Hela的生长和增殖无明显的抑制作用。

附表3.不同分子量的湖北遂州产香菇子实体三螺旋多糖F-LV-IB的体外抗S-180肿瘤活性。

     试样   剂量(毫克/毫升)   抑制率(％)    L-FV-IB11    0.005    -4.37    0.05    32.8    0.5    30.8    L-FV-IB12    0.005    16.83    0.05    20.16    0.5    25.21    L-FV-IB21    0.005    27.78    0.05    30.93    0.5    32.54    L-FV-IB31    0.005    28.92    0.05    31.18    0.5    36.11    L-FV-IB32    0.005    38.5    0.05    37.74    0.5    41.06    L-FV-IB52    0.005    41.22    0.05    43.77    0.5    45.32    L-FV-IB73    0.005    28.28    0.05    34.13    0.5    43.44

实施例2

所用香菇子实体由华中农业大学真菌研究室用其研制的4种编码为No.2，No.36，No.39和No.50的杂交菌种培养得到并公开对外出售(公众能买到)。分别将4种香菇子实体碎片依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各8小时。然后用0.9％NaCl水溶液在室温下提取三次：浸泡在0.9％NaCl水溶液中过夜，离心，收集残渣。残渣用在高压锅中热水(120℃)提取三次，每次半小时，离心，收集残渣；残渣用5％NaOH/0.05％NaBH₄水溶液于室温下提取一次，离心，收集上清液。用36％HOAc水溶液于室温下中和至pH6-8，离心，收集上清液。上清液浓缩后，用30％H₂O₂脱色至浅黄色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次以上。然后，分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得三螺旋多糖纯品，依次命名为：L-I₁，L-I₂，L-I₃，L-L₄.其中含结合蛋白质分别为5.8％，5.5％，5.2％，15.2％。将其中的结合蛋白脱去以后的多糖分别标记为LNP-I₁，LNP-I₂，LNP-I₃，LNP-I₄。

多糖构象表征方法同实施例1。4种三螺旋香菇多糖在水溶液中的特性粘数和重均分子量详见附表4。不同菌种的香菇子实体中的三螺旋香菇多糖的分子量不同，但其在水溶液和DMSO中的比值为3，<s²>z^1/2＝K M_w^α方程中的指数α为0.8-0.91；而且由高分子溶液理论计算得到其构象参数为：持续长度q＝85nm；单位围长摩尔质量M_L＝2300nm^-1；螺距h＝0.315nm。表明4种不同菌种的香菇子实体多糖在水溶液中均呈现三螺旋链构象，而在DMSO中均呈现单股无规线团构象。与实施例1相比，由杂交菌种培养的香菇子实体中提取分离出的三螺旋多糖的分子量更高。

4种杂交菌多糖试样对植入BALB/c小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤抑制率的结果见附表4。显然，本发明得到的三螺旋多糖表现出较高的抗肿瘤活性，尤其是L-I₁，L-I₂和L-I₃表现出更高的抗肿瘤活性，抑制率甚至高达70％，远远超过5-Fu的抑制率(50％)，而且具有剂量依赖性。除去结合蛋白后的三螺旋香菇多糖LNP-I₁，LNP-I₂，LNP-I₃，LNP-I₄的活性明显降低；当其三螺旋链受到破坏后，抗肿瘤活性基本消失(未示出)，表明适量蛋白质和三螺旋结构对其抗肿瘤活性有重要影响。4种多糖L-I₁，L-I₂，L-I₃，L-I₄对人体急性白血病毒细胞(HL-60)和人体乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖也有显著的抑制效果，而不会破坏正常猴肾细胞的增殖，表明其不具有毒性。比较附表2和5可知，由杂交菌种培养得到的香菇子实体螺旋多糖比市售的湖北随州产香菇子实体三螺旋香菇多糖显示更高的生物活性。因此，三螺旋香菇多糖可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品，具有极大的推广和应用前景。

附表4.杂交菌种香菇子实体三螺旋多糖在0.9％NaCl水溶液中25℃时的特性粘数、重均分子量，及其抗BALB/c小鼠体内抗S-180肿瘤活性。

试样    特性粘数    重均分子    分子链

                                          剂量               抑制率，  体重增长率，

        (毫升/克)   量×10^-5   股数      (毫克/千克×天)    (％)      (％)

L-I₁    1050        14.4        2.9        20×7             12.1      55.0

                                            60×7             47.8      29.1

L-I₂    1123        16.4        3.1        20×7             25.9      41.3

                                            30×7             40.7      34.7

                                            60×7             54.5      31.4

L-I₃    1162        16.5        2.9        20×7             70.0      27.4

                                            30×7             63.0      37.1

                                            60×7             50.0      42.7

L-I₄    1250        17.7        3.2        20×7             20.3      33.3

                                            30×7             31.8      46.1

                                            60×7             37.1      45.0

5-氟脲                                      20×7             48.6      39.1

嘧啶

空白对                                                                  44.2

照组