CD8lowT细胞群在慢性乙型肝炎感染病人中增多及人T细胞库中表位特异性单克隆TCR扩增技术的建立

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝性,非细胞病变的DNA病毒,感染后很容易导致慢性化。在HBV慢性感染的病人中,由于特异性的抗病毒T细胞免疫缺乏或损坏,常常导致病毒持续性感染并发展为严重的肝脏疾病。虽然有关T细胞对HBV抗原低反应或耐受的机制目前还不完全清楚,大量的研究提示有调节功能的CD4+和CD8+T细胞可能在抑制HBV特异性的T细胞应答中发挥重要作用。
　　CD3+CD8lowT细胞是细胞表面CD8分子下调的一群CD8+T细胞,在很多慢性持续性抗原刺激的情况下增多,如HIV感染病人,器官移植病人以及慢性寄生虫感染的小鼠。研究发现这群细胞属于2型极化T细胞,具有较低的细胞毒性,在某些情况下可通过其分泌的IL-10或细胞表面表达的膜型TGF-β1发挥抑制作用。
　　在本研究中,考虑到慢性HBV感染也是一种持续性的抗原刺激,我们的目的是探索CD8low T细胞在慢性HBV感染病人受损的CD8+T细胞应答中是否发挥作用以及何种作用。
　　一.慢性HBV感染病人外周血中CD8lowT细胞的频率高于健康人
　　本研究中我们选择了47个慢性HBV感染病人和19个健康人对照,分离这些个体的外周血单个核细胞并通过流式细胞术检测其中CD8lowT细胞的频率。我们发现慢性HBV感染病人外周血中CD8lowT细胞的频率高于健康人对照,同时发现感染HBV时间长于5年的病人较低于5年的病人含有更高的CD8lowT细胞。
　　二.病人外周血中CD8lowT细胞的频率与血浆中HLAI类分子的浓度正相关
　　我们通过ELISA检测了病人和健康人血浆HLAI类分子的浓度,发现病人血浆HLAI类分子的浓度显著高于健康人。同时发现,病人外周血中CD8lowT细胞的频率与血浆中HLAI类分子的浓度成正相关,而健康人中并未发现相关。
　　三.病人外周血中CD8lowT细胞的表型
　　通过流式细胞术检测CD8lowT细胞一些与效应和抑制有关的标记的表达,发现相比健康人,病人中的CD8lowT细胞在表型上更接近2型极化T细胞(较多的IL-4表达和较少的IFN-γ表达),并显示出调节或抑制性的特征(抑制性标志上调,特别是膜型TGF-β1)。
　　四.病人中CD8lowT细胞的频率与HBc18-27特异性CD8+T细胞应答负相关
　　通过IFN-γELISPOT检测病人和健康人HBc18-27特异性CD8+T细胞应答。发现相比正常人,病人的HBc18-27特异性CD8+T细胞应答显著降低,并且与CD8lowT细胞的频率成负相关,提示病人中的CD8lowT细胞可能具有抑制功能。
　　五.结论
　　慢性HBV感染病人外周血中CD8lowT细胞群显著增多,其在表型上趋向2型极化T细胞,且一些抑制性标志表达升高,这可能是导致慢性HBV感染病人CD8+T细胞应答低下的其中一个原因。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

Ⅰ 材料与试剂

Ⅱ 方法

材料与方法

Ⅰ 材料与试剂

一、菌株与细胞株

二、抗原肽

三、血标本

五、抗体

六、生物素化酶

七、亲和素

八、生化试剂

九、基因重组相关试剂

十、仪器设备

Ⅱ 方法

（一）抗原特异性CTL的获得

（二） 扩增gp100/HLA-A2表位特异性的单克隆TCR

结果

一．验证所设计的TCRα与β链的引物群

二．单个Jurkat细胞的RT-PCR

三．从单个人外周血CD8+T细胞中扩增TCR

四．获得gp100/HLA-A2特异性的单克隆TCR

五．gp100/HLA-A2特异性的单克隆TCR的表达

讨论

本研究的创新点和意义

参考文献

综述

附录1

附录2

致谢