HSF4在晶状体发育中的作用及其突变导致白内障的机制研究

摘要

热休克因子是生物体内的一类重要的转录因子,通过调控热休克蛋白应对内外环境的各种胁迫,并参与机体的多种生理功能。热休克因子4(Heat Shock Factor4,HSF4)在晶状体细胞中高度表达,在晶状体的形成和分化过程中起重要的作用。HSF4突变可导致先天性和老年性白内障的发生,但是HSF4导致白内障的分子机理并不完全清楚。本论文从HSF4基因与DNA损伤修复、HSF4调控DNA酶DLAD,以及HSF4和p53的相互作用关系等三个全新的方面,研究HSF4的功能及其突变引起白内障的病理机制。
　　晶状体中DNA损伤的不断累积是老年性白内障生成的一个重要原因,及时地清除DNA损伤对维持晶状体的正常功能十分必要。在本研究中,我们首先发现HSF4能够促进修复紫外线导致的DNA损伤和DNA链的断裂,而HSF4的白内障致病突变不具有修复这些DNA损伤的能力。Rad51是DNA同源重组修复通路中的关键催化酶。我们的研究发现HSF4通过调控Rad51起到DNA损伤修复功能:利用Rad51启动子的荧光素酶报告载体和染色质免疫沉淀实验,我们发现HSF4能直接结合在Rad51启动子上的热休克元件上启动其转录表达,而HSF4的白内障致病突变却失去此功能;通过实时定量PCR和免疫印迹技术,进一步证实HSF4的DNA损伤修复功能是依赖于Rad51;过表达Rad51可以回补由HSF4突变导致的DNA损伤修复障碍;喜树碱处理能够通过抑制Rad51表达水平的上调进而抑制HSF4的DNA损伤修复功能;在斑马鱼中利用morpholino技术敲除HSF4,导致斑马鱼中Rad51的表达减少,及晶状体中DNA损伤增加。我们的研究首次明确表明先天性白内障的致病基因能够直接参与DNA损伤修复,为了解先天性和老年性白内障形成的病理机制提供了一个全新的视角。
　　晶状体纤维细胞的去核过程是完成晶状体分化的必要步骤。DNase2β(DLAD)是脊椎动物晶状体中存在的主要Dnase,在晶状体分化过程中发挥重要功能,敲除DLAD的小鼠会出现核性白内障表型。通过DLAD启动子荧光素酶报告载体和染色质沉淀实验,我们的研究发现HSF4通过直接结合在DLAD的启动子上上调DLAD的转录和表达,进而促进其Dnase活性。HSF4的白内障致病突变破坏其与DLAD启动子的结合能力,丧失其上调DLAD表达的能力从而影响Dnase活性。在体内,我们应用morpholino抑制斑马鱼HSF4表达,发现HSF4下调的斑马鱼,晶状体在分化过程中细胞核的去除不完全。与之相一致的是斑马鱼DLAD的蛋白水平和Dnase活性下降。说明HSF4通过上调DLAD的表达,参与晶状体分化的去核化过程。我们的研究结果找到了一条解释HSF4突变导致白内障生成的全新分子途径,帮助我们更深入地了解HSF4在晶状体分化中的功能。
　　应用免疫共沉淀和pulldown技术,我们首次发现HSF4和p53存在相互作用。这个发现为我们研究HSF4和p53在晶状体分化和发育中的功能,揭示相关的调控通路,为我们进一步研究HSF4和p53在白内障生成中的分子机制提供了全新的思路。
　　通过对以上内容的研究,我们首先阐述了HSF4参与白内障生成的一条全新分子通路,即通过调控Rad51的表达参与DNA损伤修复。其次,我们明确了HSF4通过上调DLAD的表达促进晶状体发育过程中纤维细胞的去核化过程。最后,通过鉴定HSF4与p53的相互作用,我们为研究HSF4和p53的生理功能提供了新的方向。

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1 绪论

1.1 晶状体的发育

1.2 白

1.3 热休克因子家族

1.4 DNA损伤修复和白内障生成

1.5 p53与晶状体发育

2 材料和方法

2.1 材料和仪器

2.2 主要研究方法

3 HSF4通过调控Rad51的表达参与DNA损伤修复

3.1 实验方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

4 HSF4调控DLAD的表达促进晶状体发育的去核化

4.1 实验方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

5 HSF4与p53相互作用验证

5.1 实验方法

5.2 实验结果

5.3 讨论

6 全文总结和展望

6.1 主要研究结果

6.2 特色和创新

6.3 课题展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的学术论文目录

附录2 本论文中用到的缩略语