以斑马鱼为模式生物研究HSF4调控晶状体发育和白内障形成的机制

摘要

晶状体发生浑浊会引起白内障造成视力损伤。老化;遗传;代谢异常;外伤;辐射;中毒和局部营养不良等可引起晶状体囊膜损伤;使其渗透性增加;丧失屏障作用;或导致晶状体代谢紊乱;使晶状体蛋白发生变性;形成混浊。白内障通常可分先天性和后天性两大类。遗传学研究鉴定出超过20个白内障的致病基因;这些基因大致可以分为以下几类：晶状体蛋白;细胞膜蛋白;缝隙连接蛋白;细胞骨架蛋白;生长因子或转录因子;蛋白降解装置组分。热休克因子4（HSF4）是转录因子;可以转录激活γ-晶状体蛋白;波形蛋白;念珠状纤维蛋白以及DNA酶2等与晶状体发育和功能密切相关的蛋白的表达;但是该基因突变导致白内障形成的具体机制仍然不清楚。因此;在本研究中我们希望通过构建 hsf4 基因敲除的动物模型;并对其进行研究;探索HSF4调控晶状体发育和白内障形成的机制。 本研究采用 TALEN 技术成功构建了 hsf4 基因敲除的斑马鱼模型。通过表型分析发现;在斑马鱼中敲除hsf4基因会导致斑马鱼产生先天性白内障。之后通过对hsf4基因敲除斑马鱼进行表型研究发现 hsf4 基因敲除造成晶状体上皮细胞增多。由于晶状体纤维细胞是由晶状体上皮细胞分化而来的;那么上皮细胞数目增多很可能导致由其分化形成的晶状体纤维细胞数目也增多。之后;通过冰冻切片和免疫荧光实验对晶状体纤维细胞的骨架进行观察;证实以上推测;即敲除 hsf4 基因后会造成晶状体纤维细胞数目增多;并且异常增多的纤维细胞在晶状体内逐渐积累;最终使得其排布逐渐紊乱。除了对晶状体结构的影响之外;我们还检测了 hsf4 基因敲除对晶状体纤维细胞分化的影响。发现;敲除 hsf4 基因以后;无论是初级纤维细胞还是次级纤维细胞的去核过程都受到了显著的影响。并且;通过透射电子显微镜观察发现次级纤维细胞内细胞核;线粒体;胞内体;溶酶体等细胞器不能正常降解。这表明; hsf4对于纤维细胞的终末分化是必需的;在hsf4基因敲除的情况下纤维细胞的终末分化不能正常进行。 接下来;我们对 hsf4 基因敲除造成纤维细胞终末分化异常的分子机制进行了研究。发现在体外培养的人晶状体上皮细胞中过表达HSF4可引起p53在细胞核中聚集。之后;细胞核内的p53转录激活其靶基因Fas和Bax的表达;引起细胞凋亡信号传递激活caspase级联反应;最终引起Caspase3活性增强。并且;HSF4对Fas;Bax;caspase3的调控是依赖于p53的。之后我们利用hsf4基因敲除斑马鱼模型对体外实验的结果进行验证;发现hsf4基因敲除的斑马鱼晶状体中p53和激活型caspase3显著下调。并且;体内回补实验也证实了过表达野生型的 hsf4;p53;fas 可部分回补由于 hsf4 基因敲除所造成的细胞去核异常。以上结果表明 HSF4 可以通过调控 p53及其下游的调控因子来调节纤维细胞分化。 综上所述;在本研究中我们成功构建了 hsf4 基因敲除的斑马鱼白内障模型;应用这一模型我们直接观察了 hsf4基因敲除斑马鱼先天性白内障发生发展的病理过程;并对hsf4缺陷引起白内障的分子和细胞学机制进行了探索。发现hsf4是晶状体发育和分化过程中的一个非常重要的调控因子;可以通过维持晶状体上皮细胞与纤维细胞之间增殖和分化的平衡;促进纤维细胞的正常分化。在机制方面;我们发现HSF4可以调控p53;Fas;Bax;Caspase3等主要的凋亡相关的调控因子来促进纤维细胞的分化。我们的发现揭示了HSF4参与调控晶状体分化的新的机制;为进一步理解HSF4在晶状体中的生理功能以及白内障发生的分子机制打下了良好的基础。

目录

第一个书签之前