基于TAP技术的GABAB受体相互作用蛋白质研究方法的建立

摘要

GABAB受体(GABABR)是中枢神经系统中重要的代谢型受体，其天然配体是抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)。GABAB受体是G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCR) C家族成员，它可以通过第二信使系统介导缓慢和长时程的突触传递抑制效应，从而参与多种生理代谢过程。GABAB受体的功能失调可以导致多种中枢神经系统疾病，例如痉挛、癫痫、抑郁、焦虑、药物滥用等，因此是非常重要的药物靶点。
　　最近的研究表明，与GABAB受体具有直接或间接相互作用的蛋白质在GABAB受体介导的信号通路当中发挥重要作用，可以参与GABAB受体功能的动态调节。目前，研究蛋白质相互作用的方法有很多，但用于研究GABAB受体等膜蛋白及其相互作用蛋白质的方法却很少。本研究首先建立了一种新型的基于串联亲和纯化技术研究GABAB受体相互作用蛋白质的细胞模型。该模型是携带并能表达带有串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification, TAP)标签的GABABR基因的哺乳动物细胞。分别将TAP标签融合到GABABR的N末端或C末端，与表达载体连接构建成重组质粒后分别导入人胚肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞中，经过筛选培养获得了四个能够稳定高表达融合基因的细胞模型，并通过免疫印迹、酶联免疫吸附测定以及荧光测钙等方法检测细胞模型中融合蛋白的表达、上膜及功能。其次，对GABABR增溶的条件以及串联亲和纯化技术的步骤进行了优化，选取对GABABR增溶效果较好的去垢剂N-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside。最后，借助优化的增溶条件及纯化步骤从构建的细胞模型中纯化得到带有TAP标签的GABAB受体，进一步验证该方法的可实施性。
　　综上所述，本研究为GABABR相互作用蛋白质的大规模纯化提供了有利的实验工具，并且还可以通过凝胶电泳分离不同的蛋白条带，借助质谱鉴定复合物中的蛋白质组分。这将有助于研究GABABR调控下游信号通路的精细机制，更好地阐明与GABABR相关疾病的病理机制，从而为新药研发及疾病治疗提供理论依据。

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1 绪 论

1.1 GABAB受体结构与功能研究

1.2 GPCR相互作用蛋白研究方法和TAP技术

1.3 本研究的目的，内容和意义

2 实验技术及原理

2.1 蛋白质免疫印迹

2.2 酶联免疫吸附检测

2.3 荧光探针法检测胞内钙离子浓度

2.4 脂质体转染

2.5建立稳定表达细胞系

2.6 串联亲和纯化技术

3 实验材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

4 结果与分析

4.1 GABABR-TAP质粒的表达及功能检测

4.2 HEK293-TAPGB1/GB1TAP细胞系的构建与检测

4.3 Flp-InTM-CHO-TAPGB1/GB1TAP细胞系的构建与检测

4.4 GABAB受体的增溶和纯化步骤的优化

4.5 串联亲和纯化法提取GABAB受体

5 总结与讨论

致谢

参考文献

附录 主要符号和缩略词表