果蝇GABAB受体亚基C末端间的相互作用

摘要

γ-氨基丁酸(GABA)主要存在于中枢神经系统中，它是中枢神经系统中十分重要的抑制性神经递质,它能够通过与GABA受体相结合而行使其生物学上的功能。在神经细胞中存在着两种不同类型的GABA受体，分别是离子型γ-氨基丁酸受体—GABAA受体、GABAC受体和代谢型γ-氨基丁酸受体—GABAB受体（metabotropic GABA receptor type B，GABABR），GABABR属于G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR) C家族，它可以介导缓慢和长时程的突触传递抑制效应。GABABR受体在突触前和突触后都有分布，它在许多中枢神经系统疾病中具有重要的作用。它也被证明参与细胞的生存,指导神经生长锥,神经元迁移和定位。基于以上原因，GABAB受体可以作为多种神经系统疾病和精神疾病治疗的药物靶点。
　　黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）,一般称为“果蝇”(Fruit fly),在实验遗传学和发育生物学中是一个非常理想的生物模型，近几年以来果蝇在神经科学中包括神经药理学中越来越多地被用作一个生物模型。因为相对于典型的哺乳动物模型果蝇具有很多的优势，例如利用果蝇我们可以获的更好的可操作性的遗传基因，在较低的成本下可以得到无数的实验对象,而且人们对于果蝇的监管限制非常少。利用果蝇作为生物模型，已经证明，GABAB受体可能参与乙醇和?-羟丁酸在疼痛中的行为作用。除此以外，还有研究结果显示，果蝇的GABAB受体在发育过程中可能发挥着重要的作用，并且能够参与嗅觉作用和调节生物周期节律。
　　然而，我们仍然应该认识到昆虫与哺乳动物之间的本质性区别，只有更加清楚的了解果蝇GABAB受体（DGABABR）与哺乳动物GABAB受体之间的不同和造成这种不同的原因，我们才能更好的利用果蝇这个模型代替哺乳动物模型进行神经科学包括神经药理学方面的研究。
　　在本研究中，首先以pRK质粒作为载体，分别构建含有果蝇GABAB受体两个亚基DGABAB1（DGB1）和GABAB2（DGB2）的质粒，其中GB1和GB2的N末端分别融合了HA和Flag标签蛋白，标记为HA-DGABAB1R（HA-DGB1）和Flag-DGABAB2R（Flag-DGB2），然后把质粒以不同的组合方式转入细胞中，利用Elisa技术分别检测两个受体亚基在细胞表面的表达情况。然后把果蝇GABAB受体的膜表达模式与大鼠GABAB受体的膜表达模式进行对比，发现果蝇GABAB受体的膜表达模式与大鼠的正好相反。然后我们对引起这种差别的原因进行了探索，首先利用定点突变的方法寻找DGB2上的滞留序列，但是没有找到。随后我们利用终止突变的方法对DGB2 C末端与DGB1相互作用的关键性区域进行了探索，发现果蝇DGB2上的L777位点对于DGB1C末端与DGB2C末端之间的相互作用十分重要。
　　综上所述，本研究主要是对果蝇GABAB受体两个亚基DGB1与DGB2C末端的相互作用进行了研究，找出来DGB2C末端对于果蝇GABAB受体两亚基C末端相互作用的关键性区域，并把2001年Mario Mezler et.al所预测的DGB2的coiled-coil-domain扩展到了L777位点。

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1 绪 论

1.1 GABAB受体

1.2 果蝇的GABAB受体

1.3 本课题的研究意义、内容和目的

2 实验技术与原理

2.1 重组DNA技术

2.2 定点突变

2.3 质粒的扩增与抽提

2.4 电穿孔转染细胞

2.5 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，Elisa）

2.6 功能性测钙实验

3 实验材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

4 实验结果及分析

4.1 果蝇GABAB受体的表达

4.2 果蝇GABAB受体的功能检测

4.3 DGB2 C末端与DGB1 C末端相互作用的区域可能包括K776-D968段

4.4 DGB2 C末端与DGB1 C末端相互作用的区域可能包括K776-M820段

4.5 DGB2 C末端与DGB1 C末端相互作用的区域可能包括K776-D786段

4.6 DGB2 C末端与DGB1 C末端相互作用的区域可能包括K776-A781段

4.7 DGB2 C末端的L777是果蝇GABAB受体亚基C末端间相互作用的关键位点

5 讨论与展望

致谢

参考文献

附录 主要缩略词表