联合应用替莫唑胺和多巴胺D2受体拮抗剂抑制脑胶质瘤细胞生长的研究

摘要

胶质瘤是颅内最为常见的原发性恶性肿瘤，以生长迅速，反复复发为特点，临床预后极差。目前，原发性胶质瘤的治疗多采取以手术治疗为主，根据其恶性程度辅以术后化疗和放疗的治疗方案。替莫唑胺是胶质瘤术后化疗的首选药物，但在控制和治疗胶质瘤上仍难以达到满意的治疗效果，胶质瘤干细胞的存在是替莫唑胺耐药的一个重要原因。
　　多巴胺是人体一种重要的神经递质，主要通过与其受体结合发挥作用，多巴胺D2受体是多巴胺受体家族中的一员，在胶质瘤细胞的增殖中起正向调控作用，阻断D2受体可抑制胶质瘤的增殖。我们以增强胶质瘤的最终治疗效果目的，设想将D2受体拮抗剂和替莫唑胺联合应用，探索增强胶质瘤术后化疗效果的新方法。
　　我们发现联合应用替莫唑胺和D2受体拮抗剂（氟哌啶醇或者利培酮），与单独使用一种药物相比，可以显著增强对胶质瘤细胞增殖的抑制作用，进一步的研究结果显示两者对胶质瘤细胞的抑制作用具有明显的协同效应。我们用γH2AX蛋白表达水平来反映DAN损伤程度，结果发现D2受体拮抗剂不能造成明显的DNA损伤，但当它与替莫唑胺合用时，可以明显增强替莫唑胺对DNA的损伤作用。此外，替莫唑胺处理U251和胶质瘤干细胞后，应用RT-PCR技术检测发现肿瘤细胞DRD2基因的表达量明显上调，提示两种处理因素之间可能存在内在联系。在胶质瘤细胞中联合使用两种药物，用蛋白免疫印迹杂交实验检测相关蛋白的表达水平，发现D2受体拮抗剂可以抑制ERK通路的激活，并且可以在自噬流的晚期阶段阻断替莫唑胺诱导的保护性自噬，这很可能是D2受体拮抗能够增强替莫唑胺疗效的机制。
　　我们的实验结果为提升胶质瘤术后化疗的治疗效果提供了新的思路和方法，或可成为提升胶质瘤最终治疗效果的新的有效途径。

目录

声明

1绪言

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1 实验所用细胞

2.1.2主要实验仪器

2.1.3实验试剂和耗材

2.1.4实验所用抗体

2.1.5实验所用引物序列

2.1.6主要溶液配制方法

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 胶质瘤干细胞的提取

2.2.3 MTT检测细胞增殖

2.2.4 细胞RNA的提取及检测

2.2.5 RNA反转录和定量PCR

2.2.6 细胞免疫荧光实验

2.2.7 细胞蛋白收取及蛋白免疫印迹杂交实验

2.2.8 小鼠颅内成瘤实验

2.2.9 苏木素伊红（HE）染色

2.2.10 数据分析和处理

3结果与讨论

3.1胶质瘤干细胞的鉴定

3.2 联合应用 D2 受体拮抗剂可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

3.2.1 D2受体激活程度对胶质瘤细胞系和GSC增殖的影响

3.2.2 联合使用D2受体拮抗剂可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的抑制作用

3.3 D2受体拮抗剂和替莫唑胺的抗肿瘤效应互相协同

3.3.1 D2 受体拮抗剂和替莫唑胺协同增强对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

3.3.2 D2受体拮抗剂能够增强替莫唑胺引起的DNA损伤

3.3.3 替莫唑胺处理胶质瘤细胞可以上调DRD2的表达量

3.4 D2 受体拮抗剂通过抑制自噬实现与替莫唑胺抗肿瘤效应的协同作用

3.4.1 D2受体拮抗未能明显增强替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞的凋亡

3.4.2 D2受体拮抗剂通过抑制细胞自噬增强替莫唑胺的抗肿瘤效应

3.5 讨论

参考文献

综述:胶质瘤干细胞在替莫唑胺耐药中的研究进展

致谢