PI3K抑制剂联合Ad-PTEN抑制人脑胶质瘤细胞生长的体内外研究

摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统常见的原发性肿瘤,具有侵袭性生长,肿瘤细胞增殖快,易复发的特点。外科手术很难根除,术后放疗、化疗和生物学治疗等现有的综合辅助治疗措施虽然在一定程度上能够提高生存质量和生存期,但其临床预后仍然很差。随着肿瘤生物学和分子遗传学理论与技术的发展,目前已认识到,胶质瘤是一种多基因异常疾病,分子发生机制复杂,涉及多种细胞信号通路中细胞因子的异常表达。因此寻找与胶质瘤发病相关的基因,深入了解胶质瘤的分子病理,以及在此基础上开拓胶质瘤治疗的新策略和靶点,成为胶质瘤研究领域的一项重要内容。由此,纠正与胶质瘤发生、发展相关的基因异常的基因治疗和针对异常细胞信号通路的小分子抑制剂靶向治疗成为医学研究领域的前沿。
　　 近年的研究发现,PI3K/Akt信号转导通路是体内重要的细胞生存通路之一,在国外被视为癌细胞存活的首要通路。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,处于该信号转导的枢纽部位。在上游多种生长因子、细胞因子等的刺激下Akt经磷脂酞肌醇-3激酶(PI3K)的作用而发生磷酸化,磷酸化Akt(p-Akt)水平的增加可导致pI3K/Akt细胞生存通路的活化,促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移等。在包括胶质瘤在内的大多数人类肿瘤组织中都存在p-Akt的高表达。细胞实验及动物实验发现PI3K抑制剂LY294002对胶质瘤细胞有显著的抑制作用。然而,近年来针对信号通路的单靶点和多靶点小分子抑制剂的临床Ⅲ期试验发现其临床治疗效果并没有取得像前期体外细胞实验和动物实验那样的效果。
　　 PTEN具有脂质和蛋白双重磷酸酶活性,主要通过抑制PI3K/Akt细胞信号传导通路发挥其抑癌作用。在恶性胶质瘤细胞中常常会出现PTEN基因的缺陷导致PI3K/Akt通路的异常活化,特别是Akt的磷酸化水平增加、活性增强,引发肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移等。因此PTEN已经成为胶质瘤基因治疗的重要靶点。
　　 本研究利用PI3K抑制剂(LY294002)联合载有野生型PTEN基因的腺病毒(Ad-PTEN)作用于恶性胶质瘤细胞系,观察其对肿瘤的增殖和侵袭抑制有无联合或协同增强作用,并探讨可能存在的机制,以期为胶质瘤的综合治疗提供新的方向。
　　 本课题研究分为以下二个部分:
　　 第一部分中应用四唑盐(MTT)比色法测定LY294002单独及其联合AD-PTEN在体外人脑胶质瘤细胞系U251、LN229中的半数抑制浓度(IC50),然后通过MTT法分析肿瘤细胞增殖活性,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V-FITC检测细胞凋亡,细胞划痕、Transwell法检测胶质瘤细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测相关蛋白的表达。结果显示,LY294002单独及其联合PTEN在人脑胶质瘤体外细胞系U251、LN229中IC50近似为12.7、16.9umol/L；6.30、8.11umol/L。联合治疗组自培养第2天起,细胞增殖速率呈下降趋势,且低于对照组和LY294002治疗组。联合(LY294002+AD-PTEN)治疗组细胞周期阻滞在G0/G1期,S期减少；凋亡率增加；联合治疗组迁移和侵袭的细胞相对数少于对照组和LY294002治疗组。与对照组和LY294002治疗组比较,联合治疗组的PTEN蛋白明显上调,而PCNA、p-Akt、CyclinD1、bcl-2、MMP-9、p-FAK蛋白显著下降。
　　 第二部分建立LN229裸鼠皮下荷瘤模型,将模型分为DMS0组、空载组、LY294002组、联合组。每组6只。并在肿瘤局部多点注射治疗,每4天测量一次肿瘤体积,动态测量肿瘤生长。免疫组化法检测肿瘤标本的相关蛋白表达情况分析可能的抑癌机制。结果表明,联合治疗组对裸鼠移植瘤人脑胶质瘤的抑制作用较对照组及LY294002治疗组均明显增强；与对照组及LY294002治疗组比较联合治疗组Caspase-3、PTEN表达显著升高,p-Akt、CyclinD1、MMP9、p-FAK的表达均显著下降。
　　 结论：体内外研究中与LY294002组比较应用LY294002联合Ad-PTEN作用于人胶质瘤细胞系后,肿瘤细胞的增值、侵袭能力和迁移能力受到更显著的抑制。其分子机制为:
　　 1.联合治疗通过增强对PI3K/Akt通路阻滞作用下调了肿瘤细胞凋亡抑制蛋白、增值和侵袭相关蛋白的表达。
　　 2.外源PTEN调控FAK通路抑制了肿瘤细胞的侵袭,从而发挥比单一使用小分子抑制剂更有效的抑制胶质瘤细胞系的侵袭作用。