Ad-PTEN联合PI3K抑制剂LY294002抑制人胶质瘤细胞系LN229增殖和侵袭的研究

摘要

胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤,术后复发率高,血脑屏障的存在使常规化疗药物难以发挥作用,即使采取包括手术、放化疗、免疫治疗在内的综合治疗,预后仍然不佳。胶质瘤的发生、发展是多因素作用的结果,与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。P13K/AKT(磷酸肌醇3-激酶/丝-苏氨酸激酶)信号通路与胶质瘤的发生、发展密切相关。PTEN(第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因)是具有磷酸酯酶活性的抑癌基因,能够拮抗P13K/AKT通路表达。PTEN还通过丝裂原活化蛋白激酶(MPKA)、粘着斑激酶(FAK)等通路参与细胞生长、增殖、迁移、分化等过程。它们都是胶质瘤基因治疗的理想靶点。
　　 本课题重点研究了携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)和P13K的小分子抑制剂(SMIs)LY294002对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用,及两者之间的协同作用,并探讨了P13K/AKT通路在人脑胶质瘤发生发展中的作用和机制,尝试了多靶点联合基因治疗在胶质瘤中的作用。
　　 本课题研究分为以下三个部分。
　　 第一部分:携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)在人胚胎肾上皮细胞HEK293中进行扩增,并用噬菌斑法测定其滴度为8×109。利用腺病毒转染技术和Western-Blot法确定携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)转染LN229细胞的最佳感染复数值(MOI值)为100。用四唑盐(MTT)比色法测出LY294002在LN229中的半数抑制率(IC50)为16.33μmol/L,联合转染Ad-PTEN后的药物半抑制率(IC50)为8.32μmol/L,提示Ad-PTEN对LY294002有增敏效果,两者均在临床用药安全范围之内。
　　 第二部分:侧重在体外部分对人脑胶质瘤细胞系LN229进行研究,将LN229细胞分成6组:①空白对照组、②DMSO组、③空载病毒组、④Ad-PTEN组、⑤LY294002组、⑥Ad-PTEN+LY294002联合治疗组。分别用MTT法检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞周期、AnnexinV-FITC法检测细胞凋亡、Transwell法和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力,Westernblot检测相关蛋白的表达。结果表明:MTT显示,与LN229对照组、DMSO组和空载病毒组比较,Ad-PTEN组、LY294002组和Ad-PTEN+LY294002联合治疗组细胞的生长在治疗48h后出现明显抑制,以Ad-PTEN+LY294002联合治疗组对LN229细胞增殖的抑制作用最为明显。流式细胞周期分析显示:Ad-PTEN组、LY294002组和联合治疗组的细胞与其他三组LN229细胞相比,S期比例依次降低,细胞阻滞于G0/G1期,联合治疗组的G0/G1阻滞明显高于其他各组。细胞凋亡检测:Ad-PTEN组、LY294002组和联合治疗组的凋亡率较之其他三组凋亡率出现下降,以后者的凋亡率下降最为显著。Transwell实验和划痕实验的结果表明:Ad-PTEN组、LY294002组和联合组治疗后,LN229细胞系的侵袭和迁移细胞绝对数减少,以联合治疗组下降幅度最大。Westernblot检测发现:Ad-PTEN组、LY294002组和联合组分别治疗LN229细胞后,P13K/AKT通路下游蛋白P13K、p-AKT、PCNA、Bcl-2、MMP-2、MMP-9及CyclinD1表达水平均有明显的下调,其中联合治疗组中下调程度较单独用药显著；而抑癌蛋白Caspase-3的表达则明显上调,Ad-PTEN组和联合治疗组的出现PTEN蛋白上调,FAK蛋白下调。
　　 第三部分为体内实验,利用LN229裸鼠移植瘤皮下模型进行研究。将裸鼠随机分为空白对照组、DMSO组、空载病毒组、转染Ad-PTEN组、LY294002组、联合治疗组。瘤内多点注射给药,并绘制肿瘤生长曲线。动物处死后取出肿瘤组织,免疫组化染色。结果显示:Ad-PTEN组、LY294002组和联合治疗组中P13K、p-AKT、MMP2、MMP9、PCNA、Bcl-2及cyclinD1蛋白表达水平明显下调,而抑癌蛋白Caspase-3的表达则明显升高,并以联合治疗组对蛋白的影响最为显著。Ad-PTEN组和联合治疗组的PTEN蛋白上调,FAK蛋白下调。
　　 结论：
　　 1.LY294002单独作用于人胶质瘤细胞系LN229的IC50值为16.33μmol/l,联合Ad-PTEN后的IC50值为8.32μmol/l,均在临床应用的安全范围之内,可以作为治疗LN229细胞系的给药浓度。
　　 2.在体内、外实验中LY294002和.Ad-PTEN可以引起人胶质瘤细胞系LN229周期阻滞在G0/G1期、凋亡增加、存活率下降,侵袭和迁移的细胞数目减少。但以两者联合应用效果最佳,体现两者具有正向协同作用。
　　 3.LY294002与Ad-PTEN两者联合应用所起正向协同作用与P13K/AKT下游的PCNA、CyclinD1、Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白水平下降和caspase-3蛋白水平上升有关。并且,PTEN可以通过抑制FAK表达改变人胶质瘤细胞系LN229的生物学功能。