HBV感染小鼠与土拨鼠模型中特异性免疫应答特征研究

摘要

目的：
　　1.应用高压水尾静脉注射HBV复制小鼠模型，系统比对分析急、慢性HBV感染模型中特异性免疫应答特点差异。
　　2.应用土拨鼠WHV感染模型，研究土拨鼠T细胞抑制性受体分子Tim-3及其配体Gal-9(Galectin-9)分子特点及其在WHV不同感染状态下分子表达特点。
　　方法：
　　1.应用高压水注射pSM2、pAAV/HBV1.2质粒分别建立急性自限性HBV清除小鼠模型（Acute-resolving mouse,ARM）和慢性HBV肝内复制小鼠模型（Persistent replication mouse,PRM）；ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)检测ARM和PRM血清中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平；FACS(Fluorescence-activated cell sorting)检测质粒注射后不同时间点ARM和PRM外周和肝脏中：①主要特异性免疫应答细胞频率的动态变化及差异；②CD8+T、CD4+T细胞表面活化及抑制性受体分子表达的动态变化及差异；③APC细胞（Antigen presenting cell）表型动态变化特点及差异；④肝内HBV特异性T细胞内因子IFN-γ、TNF-a和IL-2的分泌。
　　2.应用土拨鼠模型，克隆Tim-3和Gal-9分子并分析其分子特点，应用RT-qPCR(Reverse Transcription Real Time Quantitative Polymerase China Reaction)检测其组织表达，以及Gal-9分子在WHV不同感染状态下的表达情况；制备土拨鼠Tim-3分子多克隆抗体，并应用WB(Western blot)和FACS(Fluorescence activated cell sorting)鉴定其功能。
　　结果：
　　1.急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫细胞频率动态变化及比对分析：①CD8+T细胞：HBV质粒注射后第4天（4dpi,4days post injection）在ARM和PRM中均增多，7dpi在ARM外周血中增多，21dpi在ARM肝脏中增多，而PRM中则没有此现象；②HBV特异性CD8+T细胞：4-7dpi在ARM中增多，21dpi在ARM肝脏中增多，而PRM中则没有此现象；③DC细胞（Dendritic cells）：4dpi在ARM脾脏中增多，7dpi在ARM外周血中增多，14dpi在ARM肝脏中增多，而PRM中则没有此现象；④CD4+T细胞：4dpi在ARM和PRM脾脏中增多；⑤B细胞：21dpi在ARM外周血中特异性增多；⑥MC细胞（Myeloid cells）：21dpi在PRM肝内特异性增高；
　　2.急、慢性HBV复制小鼠中CD4+和CD8+T细胞活化表型的动态变化及比对分析：①CD8+T细胞活化表型：ARM小鼠脾脏、外周血及肝脏中CD8+T细胞活化表型CD44表达较PRM增高，抑制性表型CD62L表达较PRM降低；②CD4+T细胞活化表型：ARM脾脏、外周血及肝脏中CD4+T细胞活化表型CD44表达较PRM增高，抑制性表型CD62L表达较PRM降低。
　　3.CD8+T细胞功能检测：HI后21dpi ARM肝内HBV抗原特异性CD8+T细胞分泌细胞因子的能力较PRM增强。
　　4.急、慢性HBV复制小鼠中APC细胞（Antigen presenting cells）表面分子PD-L1(Programmed death ligand1)、MHCI(Major Histocompatibility Complex I)动态变化及比对分析：①DC细胞MHCI表达：21dpi在ARM肝脏中增多；②MC细胞MHCI表达：14dpi在ARM脾脏中增多；14dpi在PRM肝脏中增多，21dpi在ARM小鼠肝脏中增多；③PD-L1：DC细胞PD-L1表达：7dpi在PRM脾脏中增多;21dpi在PRM肝脏中增多；④MC细胞PD-L1表达：21dpi在PRM脾脏中增多；21dpi在ARM肝脏中增多；
　　5.获得土拨鼠Tim-3分子576bp胞外段序列，Gal-9分子全长CDS区序列，相似性比对分析发现土拨鼠Tim-3、Gal-9分子与地松鼠相似性最高，其氨基酸水平相似性分比为97％和98%；
　　6.Tim-3分子mRNA在土拨鼠各器官组织中表达由高到底依次为大肠、脾、肺、心脏、小肠、脂肪、睾丸，而肌肉、肾脏与肝脏中未检测到；Gal-9分子mRNA在土拨鼠各器官组织中高到底依次为睾丸、肾、肝脏、大肠、心脏、肌肉、脾脏、小肠、脂肪、肺脏；
　　7.Gal-9分子mRNA在WHV慢性感染土拨鼠肝脏组织中表达升高，而在急性感染土拨鼠肝组织中表达降低；
　　8.制备兔抗土拨鼠Tim-3多克隆抗体，1:500效价用来WB(Western Blot)检测土拨鼠Tim-3分子的表达；1:50效价可用来流式检测土拨鼠PBMC细胞（Peripheral blood mononuclear cells）中Tim-3分子的表达。
　　结论：
　　1.急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫的主要免疫细胞频率存在差异：①ARM和PRM早期脾脏中均存在CD8+T细胞的致敏增殖，但PRM外周致敏的T细胞不能被募集至肝脏发挥抗病毒效应；②HBV抗原特异性CD8+T细胞仅在ARM肝脏中增殖，而PRM肝脏中无病毒特异性T细胞聚集；③ARM中DC细胞早期在脾脏中增殖，随之在外周血中升高，后期肝脏内升高的现象，而PRM中无此现象，提示PRM中DC细胞增殖能力差。
　　2.急、慢性HBV复制小鼠中T细胞活化表型及功能存在差异：①ARM脾脏、外周血和肝脏中T细胞表面受体分子表达与PRM相比，活化性受体表达升高，抑制性受体表达降低，提示PRM中T细胞活化障碍；②ARM肝内HBV特异性CD8+T细胞杀伤功能较PRM明显增强。
　　3.急、慢性HBV复制小鼠中APC细胞表面分子表达存在差异：PRM肝内DC细胞感染后期表达PD-L1升高，提示PRM中可能存在DC细胞功能耗竭；
　　4.获得土拨鼠Tim-3部分胞外段以及Gal-9全长编码序列。
　　5.Tim-3分子在土拨鼠大肠组织中表达最高，睾丸组织中最低；Gal-9分子在各组织器官中表达广泛，其在睾丸组织中表达最高，在肺脏组织中最低；
　　6.土拨鼠不同WHV感染状态下Gal-9的表达情况存在差异。
　　7.成功制备了Tim-3胞外段多兔抗土拨鼠多克隆抗体，该抗体有较高的效价和特异性，能够用于WB和FACS的检测。
　　本研究的创新点和意义：
　　1.首次利用小鼠HBV复制模型，系统比对分析了HBV急、慢性复制过程中，外周及肝内特异性免疫免疫应答特征的差异，包括特异性免疫细胞的频率、T细胞及APC细胞活化/抑制表型、T细胞功能的动态变化；
　　2.研究首次发现在HBV慢性复制小鼠中，也存在早期外周免疫器官（脾脏）中CD8+T细胞的致敏增殖，但增殖的细胞不能同ARM中一样，能够被有效募集至肝脏发挥抗病毒作用，为CD8+T细胞在清除HBV感染中作用的研究提供新的线索。
　　3.本研究首次克隆土拨鼠Tim-3和Gal-9分子序列，同时检测了Tim-3和Gal-9分子在土拨鼠不同组织中表达情况以及不同WHV感染状态下Gal-9分子的表达情况并进行分析。
　　4.首次制备抗土拨鼠Tim-3多克隆抗体，可以用来检测Tim-3蛋白在的表达。

目录

声明

中英文缩写名词对照表

前言

参考文献

第一部分急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫应答特点对比研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二分部土拨鼠Galectin-9/Tim-3分子的克隆、特点与表达分析

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述一：乙肝病毒感染过程中特异性免疫应答研究进展

综述二：Galectin-9/Tim-3信号通路在HBV感染过程对机体特异性免疫应答调控的研究进展

博士期间论文发表情况

致谢