PD-L1信号通路在土拨鼠肝炎模型中的表达及其对WHV特异性免疫应答的影响

摘要

目的：
　　 1.获得土拨鼠PD-L1和PD-L2分子的序列，表达蛋白胞外段，制备并鉴定相应的兔源性多克隆抗体。
　　 2.探索不同TLR 通路的激活对肝细胞和淋巴细胞亚群表面抑制性分子表达水平的影响。评估PD-1、PD-L1、PD-L2分子在土拨鼠肝炎模型中与疾病进展之间的关系。
　　 3.探讨在土拨鼠慢性肝炎模型中，能否通过阻断PD-1/PD-L 通路，有效恢复T细胞功能，控制病毒感染，为研制和开发有效的乙肝治疗手段提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.从慢性土拨鼠肝炎病毒（WHV）感染的土拨鼠肝组织RNA中克隆PD-L1和PD-L2的cDNA序列，测序并分析wPD-L1/-L2和其它哺乳动物相应分子的核苷酸、氨基酸同源性。
　　 2.从正常土拨鼠分离土拨鼠原代肝细胞（PWH）和外周血单个核细胞（PBMC），经Toll样受体（TLR）的配体及干扰素（IFN）刺激后荧光实时定量PCR（real time PCR）
　　 和流式细胞术（FACS）分别检测PD-L1 RNA水平和蛋白水平的表达。分析PBMCs中各种细胞亚群对TLR和IFN刺激的反应性。
　　 3.从不同WHV感染状态（未感染、急性感染、慢性感染）的土拨鼠肝组织中分离总RNA，real time PCR检测PD-L1分子RNA水平。
　　 4.在不同WHV感染时间点（未感染、急性感染早期、急性感染晚期、慢性感染）
　　 的土拨鼠中分离PBMC，FACS检测并分析不同细胞亚群（CD4和CD8细胞）PD-1和PD-L1分子的表达水平。
　　 5.原核表达并纯化wPD-L1/-L2的胞外段，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清并纯化得到多克隆抗体。用ELISA法检测抗体的效价。构建表达wPD-L1全长和wPD-L2胞外区及跨膜区的真核表达质粒，转染幼仓鼠肾细胞（BHK）后收集培养细胞，用Western blot和免疫荧光鉴定抗体的结合力和特异性。
　　 6.在不同WHV感染时间点（未感染、急性感染早期、急性感染晚期、慢性感染）的土拨鼠中分离PBMC，用wPD-L1/-L2多抗体外阻断PD-1/PD-Ls通路，分别用[2-3H]法和FACS检测抗原特异性的T细胞的增殖和杀伤功能。
　　 结果：
　　 1.获得wPD-L1和wPD-L2分子编码区（CDS）序列。wPD-L1基因CDS 全长为864bp，与人、猪、小鼠、牛的核酸同源性分别为84.9％、82.1％、75.3％、80.9％，蛋白同源性为75.9％、71.9％、66.2％、70.4％；wPD-L2 全长822bp，与人、猴、猪、小鼠核酸同源性分别为83.8％、83.2％、80.3％、78.0％，蛋白同源性为72.9％、72.5％、68.8％、70.9％，wPD-L1与wPD-L2 同源性为31.4％。
　　 2.PWH和PBMC的wPD-L1基础表达水平较低，经TLR 配体及IFN 刺激后，wPD-L1 RNA水平和蛋白水平的表达诱导性上调。其中，TLR1/2、3、4、7、IFN-α、IFN-γ对PWH 上调作用明显，其他配体无明显刺激作用。TLR4、7 对PBMC 上调作用较强，TLR1/2、3、IFN-α、IFN-γ作用较弱，TLR2/6、5、9的作用不稳定。CD4-细胞对TLR和IFN 刺激的反应强于CD4+细胞。
　　 3.正常土拨鼠肝组织内wPD-L1 RNA表达水平明显高于PWH，在急、慢性感染动物肝组织中略有上调，在HDV/WHV 重叠感染中，肝内wPD-L1水平显著升高。
　　 4.与肝组织内不同，慢性WHV 感染中，PBMC的wPD-1和wPD-L1表达明显高于正常水平。在急性感染中，wPD-1和wPD-L1表达水平上调，wPD-1 于急性感染早期表达较高，而wPD-L1 于急性晚期表达较高。5.构建wPD-L1/-L2的原核表达质粒pET28a-wL1和pET30a-wL2，转化BL21(DE3)plyS表达菌，经过IPTG 诱导表达获得重组His-wPD-L1和His-wPD-L2胞外区蛋白。用镍柱纯化浓缩后，免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测到抗血清效价大于1:100 万，用SPA 柱吸附纯化血清得到多克隆抗体（IgG）。
　　 6.用瞬时转染真核表达质粒获得的wPD-L1/-L2 检测抗体，多抗Western blot 效价均约为1:2000，免疫荧光（IF）效价分别为1:100（抗wPD-L1）和1:200（抗wPD-L2）。
　　 7.在部分急、慢性感染的土拨鼠的PBMC中，阻断wPD-L1 可以上调抗原特异性T细胞的增殖和杀伤功能，阻断wPD-L2 仅在少数动物中促进特异性T细胞增殖，而对杀伤功能无明显影响。
　　 结论：
　　 1.成功获得土拨鼠PD-L1/-L2的全长序列。
　　 2.TLR 配体和IFN 对PWH和PBMC 上PD-L1分子具有上调作用。PD-L1的这种诱导性表达与肝炎病毒感染中天然免疫系统的激活相关。急、慢性感染中PBMC表达PD-1/PD-L1分子明显上调，与感染过程中T细胞功能变化有关。
　　 3.肝细胞并非肝内PD-L1的主要来源。在感染过程中肝脏总体PD-L1的变化不明显，这与肝脏本身的免疫耐受功能有关。
　　 4.制备了特异性的wPD-L1/-L2 多克隆抗体，用于检测wPD-L1/-L2在组织或细胞中的表达情况。该抗体体外阻断PD-1/PD-L1 通路后，能在部分动物中有效促进特异性T细胞增殖和脱颗粒功能。
　　 5.体外阻断实验在部分动物中不能发挥作用，表明参与T细胞功能抑制是一个多因素的复杂系统，单纯阻断PD-1/PD-L1 通路不能适用于所有个体，可能需要联合多种治疗才能达到有效的治疗效果。
　　 本研究的创新点及意义：
　　 1.系统研究了TLR 信号和IFN 对PWH和PBMC细胞不同亚群表面PD-L1分子表达的影响，为研究特异性T细胞应答与天然免疫系统之间的关系提供了实验依据。
　　 2.在土拨鼠嗜肝病毒感染模型中研究了不同病毒感染状态下抑制性信号通路PD-1/PD-L1的表达和变化情况，为HBV的发病机理和慢性化的免疫机制提供了参考。
　　 3.利用纯化wPD-L1/PD-L2 蛋白制备多克隆抗体，体外阻断PD-1/PD-L1 通路能够部分重建特异性T细胞应答，为以后的体内阻断实验提供依据，并提出了该阻断方法的缺点和可能的优化措施。

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论文说明：中英文缩略词表

声明

PD-L1 信号通路在土拨鼠肝炎模型中的表达及其对WHV 特异性免疫应答的影响 前 言

第一部分土拨鼠PD-L1/-L2 的克隆，原核表达及抗体制备

第二部分WHV 感染土拨鼠中PD-1/PD-L1 的表达及对特异性免疫应答的影响

综 述：慢性病毒感染对T 细胞应答的影响

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