一种HBV感染小鼠模型的构建方法和应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，提供了一种乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型的建立方法。本发明采用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV单拷贝线状基因组，将PCR产物转染Huh7、HepG2以及293T细胞，以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养细胞上清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)；用尾静脉高压水动力法将PCR产物注射C57BL/6J小鼠，以免疫组化检测小鼠肝组织中的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，ELISA检测小鼠血清中的HBsAg、HBeAg。本发明建立了一种新的HBV感染小鼠模型，该模型制备方法简单，并且肝组织内存在与HBV cccDNA类似的HBV基因组。为研究HBV cccDNA降解机制、药物清除以及乙肝患者血清样本中的HBV生物学特性等提供一种新的工具。

说明书

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用HBV基因组PCR产物注射小鼠建立一种HBV感染小鼠模型，以及该模型的应用。

背景技术：

乙型肝炎病毒(HBV)是严重危害人类健康的病原体，目前全球约有3亿人为慢性HBV感染者。HBV感染不仅可引起急性、慢性肝炎，并且是发展中国家人群发生肝硬化、肝癌的重要原因。虽然接种乙肝疫苗能有效预防HBV感染，但对于慢性HBV感染，目前的药物仅能抑制病毒复制，然而并不能作用于存在于肝细胞核内的HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)，这是抗HBV药物研发面临的巨大挑战(参见文献：Baltayiannis G,Karayiannis P.Treatment options beyond IFNαand NUCs for chronic HBV infection:expectations for tomorrow.J Viral Hepat.2014；21(11):753-61.；Nassal M.HBVcccDNA:viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitisB.Gut.2015；64(12):1972-84.)。

建立能模拟人类感染HBV状态的小动物模型对于HBV感染、致病机制研究以及抗HBV药物研发极为重要。目前这类小动物模型主要有鸭乙型肝炎模型(DHBV)、土拔鼠肝炎模型(WHV)、HBV转基因小鼠模型、HBV质粒水动力注射小鼠模型等(参见文献：Allweiss L,Dandri M.Experimental invitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection.JHepatol.2016；64(1Suppl):S17-31.；Dandri M,Lutgehetmann M,Volz T,PetersenJ.Small animal model systems for studying hepatitis B virus replication andpathogenesis.Semin Liver Dis.2006；26(2):181-91.)。DHBV、WHV虽然都能引起慢性感染，但与人HBV的基因结构以及致病性方面存在不同；HBV转基因小鼠模型在染色体中整合HBV基因组，对HBV免疫耐受，且不能产生cccDNA；高压水动力注射HBV基因组质粒的小鼠能较长时间产生HBV抗原及病毒颗粒，并发生血清学转换，但该模型中的HBV基因组存在的形式不同于cccDNA，且持续时间有限。

发明内容：

本发明的目的在于建立一种在肝组织中存在HBV基因组双链环状DNA的HBV感染小鼠模型，为研究HBV cccDNA降解机制、药物清除以及乙肝患者血清样本中的HBV生物学特性等提供一种新的工具。

本发明将线状单拷贝HBV基因组DNA高压水动力法尾静脉注射小鼠，随后在小鼠肝细胞内检测到HBcAg，血清中检测到HBsAg和HBeAg，代表了一种新的HBV小鼠感染模型。本模型的建立方法简单，尤其适合针对临床HBV血清标本快速建立小鼠感染模型，且该模型中的HBV基因理论上能形成闭合双链环状结构，类似于cccDNA，因而在研究cccDNA降解机制、药物清除以及乙肝患者血清样本中的HBV生物学特性、药物筛选等方面具有重要用途。

本发明的主要技术方案如下：

本发明用HBV基因组PCR产物注射小鼠建立一种HBV感染小鼠模型。

本发明提供了一种HBV感染小鼠模型的构建方法，是用线状单拷贝HBV基因组注射小鼠而制备成功。

本发明注射小鼠的线状单拷贝HBV基因组可通过PCR扩增获得，制备方法简单。

本发明构建的HBV感染小鼠模型，肝组织内存在与HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)类似的HBV基因组。

本发明采用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV单拷贝线状基因组，将PCR产物转染Huh7、HepG2以及293T细胞，以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养细胞上清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)；用尾静脉高压水动力法将PCR产物注射C57BL/6J小鼠，以免疫组化检测小鼠肝组织中的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，ELISA检测小鼠血清中的HBsAg、HBeAg。

细胞转染以及小鼠体内实验均用质粒pAAV-HBV1.2作为阳性对照。

结果显示：HBV基因组PCR产物转染Huh7、HepG2以及293T细胞均可分泌表达HBsAg和HBeAg；PCR产物注射小鼠后，肝组织中检测到HBcAg，血清中检测到HBsAg和HBeAg，HBsAg和HBeAg最长持续时间分别为59和38天，血清中HBsAg和HBeAg水平以及持续时间与质粒pAAV-HBV1.2注射的小鼠总体相似。本发明建立了一种新的HBV感染小鼠模型，该模型制备方法简单，并且肝组织内存在与HBV cccDNA类似的双链环状HBV基因组。

本发明为研究HBV cccDNA降解机制、药物清除以及乙肝患者血清样本中的HBV生物学特性、药物筛选等提供了新的模型。

附图说明：

图1：扩增HBV全基因组的策略(Primer P1，Primer P2以及P1、P2即引物P1、引物P2，DR1为HBV基因组中的direct repeat 1)。

图2：质粒pMD18T-HBV1.0酶切以及HBV基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析；其中1:10000bp DNA Marker；2:pMD18T-HBV1.0酶切(KpnI/HindIII)；3:HBV基因组PCR产物。

图3：ELISA检测不同形式的HBV DNA转染Huh7、HepG2、293T细胞后培养上清中的HBsAg与HBeAg(*P<0.05，PCR与pAAV-HBV1.2组相比)。

图4：ELISA检测小鼠血清中的HBsAg和HBeAg；其中A：小鼠血清中HBsAg水平的动态变化；B：小鼠血清中HBeAgAg水平的动态变化(*P<0.05，PCR与pAAV-HBV1.2组相比)。

图5：免疫组化检测小鼠肝组织中HBcAg的表达。

具体实施方式：

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1

一、材料

1.细胞与质粒

人肝癌细胞Huh7、HepG2以及人胚肾(HEK)293T细胞系由第二军医大学微生物学教研室保存(也可直接购自中科院细胞所)；pMD-18T克隆载体以及质粒pUC18为Takara产品。

2.质粒

含1.2拷贝HBV基因组的腺相关病毒骨架质粒pAAV-HBV1.2由台湾大学陈培哲教授馈赠(也可根据以下文献方法制备得到：Huang LR,Wu HL,ChenPJ,Chen DS.An immunocompetent mouse model for the tolerance of humanchronic hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103(47):17862-7.)；基因克隆载体pMD-18T为Takara公司产品。

3.引物

扩增HBV完整基因组的引物由Takara公司合成，上、下游引物序列分别为：

P1：5′-TTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3′(SEQ ID NO:1)；

P2：5′-GTTGCATGGTGCTGGTGCGC-3′(SEQ ID NO:2)。

4.试剂

PrimeSTAR Max DNA聚合酶预混液(含有PCR反应中除了模板和引物以外的各种成分)购自Takara公司。

DMEM完全细胞培养基，含10％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100mg/ml链霉素，调pH至7.4。配置培养液的各种组分均购自Invitrogen公司。

哺乳动物细胞转染试剂Lipofectamine 3000购自于Invitrogen公司；HBsAg、HBcAg ELISA试剂盒购自上海科华生物工程股份公司。

5.实验动物

C57BL/6J小鼠购自西普尔-必凯实验动物有限公司。

二、实验方法：

(一)HBV基因组PCR扩增与质粒构建

1、以质粒pAAV-HBV1.2为模板，用引物P1、P2扩增HBV全长基因组，PCR扩增反应组分包括：1)质粒pAAV-HBV1.21μl(0.1μg)；2)引物P1、P2各1μl(10pmol)；3)PrimeSTAR Max DNA聚合酶预混液10μl；4)灭菌重蒸水38μl。将上述混合物置于一个微量离心管内，充分混匀，于PCR仪上进行热循环反应：先94℃30sec充分变性；然后94℃10sec，60℃10sec，72℃3min，共30个循环；最后降温到4℃。引物P1、P2位于HBV基因组高度保守的preC基因起始处，也正好在HBV基因组负链的5′和3′的末端(图1)。

2、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中回收扩增出的HBV基因组，将回收的HBV基因组与pMD-18T克隆载体连接，得到含有单拷贝HBV基因组的质粒pMD18T-HBV1.0，用限制性内切酶KpnI/HindIII酶切鉴定(图2)，再进行DNA测序确认。所用方法均参照分子克隆实验指南第三版(科学出版社，2002年第一版)。

3、用质粒pMD18T-HBV1.0为模板，PCR扩增HBV基因组，方法同上所述，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收以后用于后续的细胞转染和小鼠尾静脉注射。

(二)细胞培养、转染与细胞上清中的HBsAg、HBcAg检测

1、Huh7、HepG2以及HEK293T用DMEM完全培养基培养，置于37℃、5％CO2孵箱中。将处于对数生长期的上述三种细胞传代接种于24孔板内，每孔个50000细胞，培养基500μl，置于37℃5％CO₂孵箱内培养过夜。

2、用Lipofectamine 3000试剂将质粒pAAV-HBV1.2、pMD18T-HBV1.0、pUC18(作为阴性对照用)以及HBV基因组PCR产物分别转染接种于24孔板、过夜培养的Huh7、HepG2以及HEK293T细胞，质粒以及PCR产物用量均为0.5μg，操作按照试剂使用说明进行。将细胞培养板置于孵箱内，6h后吸除细胞培养上清，每孔加入500μl完全DMEM培养基，置于孵箱内，48h后收集细胞培养上清，用商品化ELISA试剂盒检测培养上清中的HBsAg和HBcAg。检测方法参照试剂盒使用说明。

HBV基因组为环状，聚合酶基因与S、C、X基因重叠，C基因和X基因之间也有部分重叠。pAAV-HBV1.2质粒含完整的线状HBV基因组，可以表达HBV全部蛋白；pMD18T-HBV1.0中，HBV基因组在C基因起始密码子后断开，故在细胞内仅表达HBsAg，不能表达HBeAg及HBcAg；HBV基因组PCR产物末端在C基因的起始部分

(GCGCACCAGCACCATGCAAC↓TTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCT(SEQ>ATG为C基因起始密码子，↓为断点位置，即HBV基因组PCR产物的末端位置)，PCR产物如果不连接为环状结构，则不能表达出HBeAg及HBcAg。

结果如图3所示，pAAV-HBV1.2、pMD18T-HBV1.0以及HBV基因组PCR产物转染的细胞上清中均可检测到HBsAg，质粒pAAV-HBV1.2和HBV基因组PCR产物转染的细胞上清中可检测到HBeAg，表明线状HBV基因组在细胞内连接环化。与预想一致，pMD18T-HBV1.0转染的细胞上清中未检测到HBeAg。

(三)小鼠注射与小鼠血清中HBsAg和HBcAg的检测

将质粒pAAV-HBV1.2、HBV基因组PCR产物溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)，分别高压水动力法尾静脉注射4周龄、16g左右的雄性C57BL/6J小鼠，体积2ml，质粒以及PCR产物分别用4μg，5-7秒完成注射，以注射2ml PBS为阴性对照。从尾静脉注射后第3天开始，每隔7天从小鼠眼眶取血，用商品化ELISA试剂盒检测小鼠血清中的HBsAg和HBcAg。每组6只小鼠。结果如图4所示：与注射pAAV-HBV1.2质粒的小鼠相似，HBV基因组PCR产物直接注射的小鼠血清中也产生HBsAg和HBeAg。两组小鼠血清中HBsAg持续时间最长均为59天，在HBsAg阳性的九个时间点中，两组小鼠血清HBsAg水平在六个时间点无显著性差异(第10、17、24、45、52、59天)；与HBsAg相比，血清中HBeAg降低的速度快，持续时间短，pAAV-HBV1.2与HBV基因组PCR产物注射组的HBeAg持续时间最长分别为45和38天。除第10天，其他时间点两组小鼠血清中HBeAg水平无显著性差异。

(四)免疫组化检测小鼠肝组织内HBcAg

在小鼠尾静脉注射HBV DNA后第1天、第4天和第7天取肝组织，用免疫组化检测其肝细胞内HBcAg的表达，由谷歌生物完成。结果如图5所示，在注射1、4、7天后，pAAV-HBV1.2与HBV基因组PCR产物注射小鼠的肝细胞中均可检测到HBcAg的表达。

上述实验结果表明，HBV基因组PCR产物无论在体外培养的细胞中，还是在小鼠肝组织中，都能连接形成环状结构，表达出HBeAg。

本模型的建立方法简单，尤其适合针对临床HBV血清标本快速建立小鼠感染模型，且该模型中的HBV基因能形成闭合双链环状结构，类似于cccDNA，因而未研究HBV cccDNA降解机制、药物清除以及乙肝患者血清样本中的HBV生物学特性等提供了新的模型。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。