膀胱癌相关环状RNA-2(BCRC-2)调控microRNA-558-乙酰肝素酶通路对膀胱癌细胞生物学行为的影响及机制研究

摘要

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率一直呈升高趋势。手术和术后化疗是治疗膀胱癌的主要手段。尽管膀胱癌的治疗在手术技术及化疗药物方面有了一些进步，但由于膀胱癌具有易复发、易侵袭和易转移等生物学特点，其整体的治疗效果并没有显著的改善。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类环形的非编码RNA，过去曾被认为是基因转录剪接中发生错误的“副产品”。随着高通量测序和生物信息学技术的快速进展，目前研究发现多种动、植物细胞内存在数千种稳定高表达的circRNA，大多数定位于细胞浆中，具有细胞、组织、发育阶段、疾病相关等表达特异性，并且对基因表达发挥着重要的调控作用。为了研究circRNA在膀胱癌组织中的表达以及对膀胱癌细胞生物学行为的影响，通过膀胱癌及正常膀胱组织高通量测序、组织及细胞验证，选取膀胱癌相关环状RNA-2（bladder cancer related circular RNA-2，BCRC-2）作为研究对象，并通过体内外实验进一步研究BCRC-2对膀胱癌细胞生物学行为影响，并以circRNA可作为“microRNA（miRNA）分子海绵”为切入点，研究BCRC-2的作用机制。
　　本文分为以下三个部分：
　　第一部分:人膀胱癌组织中环状RNA的表达及膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）在膀胱组织及细胞中的表达研究
　　目的：检测人膀胱癌组织和正常膀胱组织中环状RNA（circRNA）的表达情况，随后选择表达差异明显的circRNA进一步研究。
　　方法：首先对人膀胱癌组织及配对的正常膀胱组织进行环状RNA高通量测序，通过生物信息学分析，选取在膀胱癌组织和正常膀胱组织中表达差异明显的circRNA进行下一步研究。然后，设计针对特定circRNA的正向及反向引物，通过逆转录PCR（RT-PCR）确认其在膀胱癌组织及细胞中的存在，并且通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测其在膀胱癌组织和细胞中的表达情况，验证是否与测序分析结果相一致。最后，通过RNA荧光原位杂交技术（FISH）了解circRNA在细胞内的定位。
　　结果：1.通过对3对人膀胱癌组织及配对的正常膀胱组织进行circRNA高通量测序，共检测出16,535个circRNA，大部分来源于外显子（88.9％），其他来源包括内含子、lincRNA、基因间隔区（intergenic region）、3’UTR和5’UTR等。2.在检测出的circRNA中，共有571个circRNA在膀胱癌组织和正常膀胱组织表达差异较为明显，其中有524个circRNA在膀胱癌组织中表达明显下降（91.2%），有47个circRNA在膀胱癌组织中表达升高。3.通过RT-PCR证实了膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）在膀胱癌组织和细胞中的存在，并且用qRT-PCR定量检测了BCRC-2在44对膀胱癌组织及正常膀胱组织的表达，发现与正常膀胱组织相比，BCRC-2在膀胱癌组织中明显低表达（35/44，79.5%），并且在高病理分期（31/33）、分级（28/31），发生淋巴结转移（16/17）及血管侵袭（15/15）的患者中，BCRC-2的下降水平尤为明显；以永生化尿路上皮细胞SV-HUC-1细胞为对照，BCRC-2在膀胱癌细胞系T24T和UMUC3中表达亦明显下降（P<0.01）。4.对比RNase R消化前后的BCRC-2和其线性HIPK3mRNA的表达水平，发现用RNase R消化后BCRC-2表达水平与未消化组相比无明显变化，而RNase R消化后，HIPK3mRNA表达水平明显下降（P<0.01）。5.通过RNA荧光原位杂交发现BCRC-2主要定位在膀胱癌细胞的细胞浆中。
　　结论：膀胱癌组织中存在有大量的circRNA，大部分为外显子来源，与正常组织相比表达明显下降。BCRC-2主要定位在膀胱癌细胞的细胞浆，其在膀胱癌组织和细胞中的表达均明显下调，且与患者的病理分期、分级、淋巴转移和血管侵袭密切相关，提示BCRC-2可能在膀胱癌发生发展过程发挥重要的调控作用。
　　第二部分:膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）对膀胱癌细胞生物学行为影响的体内外实验
　　目的：研究BCRC-2对膀胱癌细胞生物学行为的影响。
　　方法：1.构建BCRC-2过表达质粒，将其转染T24T和UMUC3膀胱癌细胞系，通过qRT-PCR定量检测转染后BCRC-2升高水平，以证实过表达质粒的有效性；2.建立T24T和UMUC3过表达BCRC-2的稳筛细胞系，通过细胞划痕、Transwell细胞侵袭、迁移等实验，检测过表达BCRC-2后，T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移能力发生的变化；3.构建针对BCRC-2的小干扰RNA（siRNA），将T24T及UMUC3细胞中的BCRC-2敲低后，再通过细胞划痕、Transwell细胞侵袭、迁移等实验，检测T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移能力的变化；4.通过qRT-PCR和Western blot，分析过表达或干扰BCRC-2后，T24T和UMUC3细胞中，金属基质蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平变化；5.建立裸鼠膀胱癌皮下移植瘤和肺转移瘤模型，分析过表达BCRC-2后，是否能对裸鼠皮下移植瘤及肺转移瘤产生影响。
　　结果：1.转染BCRC-2过表达质粒后，与转染空质粒组（vector）相比，T24T（升高113.8±12.87倍）和UMUC3（升高195.6±14.77倍）细胞中BCRC-2的表达水平均有不同程度的明显升高；2.与转染vector组细胞株相比，过表达BCRC-2后，T24T和UMUC3细胞的侵袭、迁移能力明显下降；反之将T24T和UMUC3细胞中的BCRC-2敲低后，膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力增加；3.过表达BCRC-2后，与vector组相比，T24T和UMUC3细胞中MMP-9和VEGF mRNA及蛋白表达均明显下降，而敲低BCRC-2后，它们的表达增加；5.裸鼠皮下移植瘤和肺转移瘤模型显示，过表达BCRC-2可明显抑制膀胱癌细胞的生长和肺转移。
　　结论：过表达BCRC-2可明显抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力，其在膀胱癌的发展过程中起重要作用。
　　第三部分:膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）通过调控miR-558影响膀胱癌细胞生物学行为的机制研究
　　目的：探索BCRC-2调控膀胱癌细胞侵袭、迁移能力的作用机制。
　　方法：1.通过交叉比对miRanda、PITA和RNAhybrid数据库，预测可与BCRC-2结合的microRNA（miRNA）；2.设计针对BCRC-2环化结合区序列的生物素标记探针，并用RNA pulldown证实探针可特异性结合BCRC-2，并用qRT-PCR检测T24T和UMUC3细胞中与BCRC-2结合的miRNA表达水平；3.通过RNA FISH共定位BCRC-2和miRNA，证实二者的结合；4.通过qRT-PCR检测miRNA在膀胱癌组织及细胞中的表达情况，并构建miRNA mimics和inhibitor，分别转染后，通过细胞划痕、Transwell侵袭、迁移和血管形成实验，研究miRNA对膀胱癌细胞侵袭、迁移和血管形成的影响；5.通过qRT-PCR和western blot研究miRNA对靶基因的影响；6.共转染BCRC-2和miRNA mimics，通过qRT-PCR、western blot、细胞划痕、Transwell侵袭、迁移和血管形成实验，研究BCRC-2和miRNA对膀胱癌细胞侵袭、迁移和血管形成能力的影响。
　　结果：1.通过数据库比对预测了12个可与BCRC-2结合的miRNA；2.生物素标记的BCRC-2pulldown探针可特异性结合BCRC-2；3.在T24T和UMUC3细胞中，BCRC-2可与miR-558结合，并且RNA FISH证实二者共定位在癌细胞的细胞浆中；4.miR-558在膀胱癌组织中的表达要明显高于正常膀胱组织，同样地其在T24T和UMUC3细胞中的表达也要高于SV-HUC-1细胞；5.转染miR-558mimics后可增加T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移和血管形成的能力，并可增加乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）及其下游MMP-9和VEGF的表达水平，反之，转染miR-558inhibitor则抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移和血管形成，并且降低HPSE、MMP-9和VEGF的表达；6.BCRC-2可逆转miR-558对T24T和UMUC3细胞侵袭、迁移和血管形成的促进作用。
　　结论：BCRC-2可吸附结合miR-558，减弱miR-558对靶基因HPSE及其下游MMP-9和VEGF的促进作用，最终抑制膀胱癌细胞的侵袭、迁移和血管形成能力。

目录

声明

全文缩写词表

引言

第一部分 人膀胱癌组织中环状RNA的表达及膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）在膀胱组织及细胞中的表达研究

实验材料

实验方法

实验结果

实验结论

第二部分 膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）对膀胱癌细胞生物学行为影响的体内外实验

实验材料

实验方法

实验结果

实验结论

第三部分 膀胱癌相关环状RNA-2（BCRC-2）通过调控miR-558影响膀胱癌细胞生物学行为的机制研究

实验材料

实验方法

实验结果

实验结论

讨论

总结

参考文献

综述:环状RNA与癌症关系的研究进展

附录攻读博士学位期间发表的论文

致谢