番茄RING-finger型E3泛素连接酶基因LeRma1全长cDNA克隆及其抗旱相关性研究

摘要

植物在自然界生长经常受到非生物胁迫影响，干旱胁迫是制约植物生长和发育的最重要的因素之一，严重影响植物正常生长。番茄（Lycopersicon eseulentum Mill.）是最重要的栽培作物和经济作物之一，然而干旱环境严重影响了番茄的生长发育和产量。因此，如何提高番茄对干旱胁迫的抗性以及通过分子生物学手段改良番茄抗逆性、培育相关新品种，具有极其重要的现实意义。
　　泛素/26S蛋白酶体途径（ubiquitin/26S proteasome pathway，UPP）是目前已知最有效的、最具特异性的蛋白质降解途径。该途径介导了真核生物80％-85%的蛋白质降解，参与了细胞多项生命活动过程，在植物生长发育和逆境胁迫中，对于维持细胞正常生理功能具有重要意义。E3泛素连接酶是泛素蛋白酶体途径中的关键酶，它可以通过泛素化降解与胁迫信号有关的成分来响应对干旱的胁迫，在植物抗旱中发挥着重要作用。
　　本论文为研究番茄中E3泛素连接酶对干旱胁迫的响应情况，同源克隆出番茄的LeRma1基因cDNA全长，在对其进行生物信息学预测的基础上，分析LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及干旱胁迫下的表达情况，同时对其他已知的抗旱相关基因进行了表达分析，并对胁迫过程中的生理特性进行研究。还进一步研究了LeRma1基因在盐、碱、高温、低温等其他非生物逆境胁迫下的表达情况，其主要内容与结果如下：
　　1、以番茄‘哈大粉801’为试材，利用RT-PCR技术，对番茄E3泛素连接酶基因 LeRma1进行克隆，得到1个 E3泛素蛋白连接酶基因 LeRma1（GenBank:XM_004243764.1）的cDNA全长序列，其序列长度为729 bp，编码242个氨基酸。分子量为27.05 kD，理论pI值为7.97。对番茄LeRma1蛋白进行二级结构的预测，结果表明该蛋白主要由loop环（78.9%）、α螺旋（19.0%）构成，此外还有少量的β折叠（2.1%），在37-86氨基酸残基处有1个RING-type锌指蛋白结构区；对番茄LeRma1蛋白进行同源性分析，发现番茄LeRma1蛋白与马铃薯的同源性最高（相似度为91%），与其他植物，如毛果杨、大豆、黄瓜等作物的同源性为60%以下，说明LeRma1蛋白在这些植物中同源性较低。
　　2、对LeRma1基因在番茄成株各部位的表达情况进行分析，表明该基因在成株番茄的根、茎、叶、花和果实中均有表达，且表达差异不显著。
　　3、利用半定量RT-PCR，对番茄幼苗进行干旱胁迫处理（0 d、1 d、3 d、6 d、8 d、10 d、复水后1 d），干旱胁迫下，LeRma1基因在番茄叶片和根部均有表达，在叶片中的表达量均呈上升趋势，而在根部中的表达变化不明显。进而利用实时荧光定量PCR检测其在干旱胁迫处理（0 d、3 d、6 d、10 d、复水后1 d）下番茄的叶片和根部中表达情况。结果表明，在干旱胁迫处理下，LeRma1基因在番茄叶片的表达量总体上与对照相比呈现明显的上升趋势，而在根中表达水平整体低于叶片，说明干旱胁迫下番茄中该基因的表达存在一定的组织差异性。在干旱胁迫最严重时期（10 d），该基因在叶片中的表达量达到最大值。初步认定LeRma1是一个受干旱诱导增强表达的基因且在叶片中优势表达。
　　4、在番茄干旱胁迫下（0d、1d、3d、6d、8d、10d、复水后1d），对其他抗旱相关基因（DREB2A、LEA、ABI3）进行表达分析。结果表明，干旱胁迫下，抗旱相关基因LEA在番茄叶片和根部也均有表达，在叶片中，其表达量呈上升趋势，而在根部的表达量变化不明显；与对照相比，抗旱相关基因 DREB2A、ABI3在番茄叶片中均有增强表达，且在整个干旱过程中，表达量变化不明显，而在根部，这两个基因基本没有被检测出来。
　　5、与此同时，在干旱胁迫下（0d、1d、3d、6d、8d、10d、复水后1d），对番茄的部分生理指标进行了测定，发现丙二醛含量呈升高趋势，在干旱10 d时，MDA含量达到最大，说明此时膜脂过氧化程度达到最大，质膜系统严重损伤。为维持番茄正常的生理代谢机能，体内的保护酶系统（POD、SOD、CAT）发挥作用，活性均上升。
　　6、为了进一步研究该基因对其他非生物胁迫的响应情况，对番茄进行盐（200 mmol/L NaCl）、碱（100 mmol/L Na2CO3）、高温（40℃）、低温（4℃）胁迫处理，并取胁迫后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h幼苗的根部和叶片，利用RT-PCR方法，对LeRma1基因进行表达分析，结果表明，在以上盐、碱、高温、低温胁迫下，LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达都有增强的趋势，且该基因在叶片中均是胁迫3h后起始诱导增强表达。
　　试验结果表明，番茄LeRma1基因在叶片中响应干旱胁迫的应答，并可能在番茄抵抗干旱及其他非生物胁迫中发挥一定的作用，但具体途径还需进一步的研究。本研究结果将为后续利用转基因的方法鉴定该基因在非生物胁迫中的功能奠定基础。

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第1章 绪论

1.1 植物泛素蛋白酶体途径概述

1.2泛素蛋白酶体途径对植物生长发育的调控

1.3泛素蛋白酶体途径在植物逆境胁迫中的作用

1.4 研究目的和意义

1.5 本研究技术路线

第2章 番茄LeRma1基因的克隆及表达分析

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 干旱胁迫下，LeRma1及其他抗旱相关基因的表达分析

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 干旱胁迫下，番茄植株生理指标的测定

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第5章LeRma1在盐、碱、高温、低温胁迫下的表达分析

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

结论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

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