几种产毒海洋微藻的膜分类芯片检测技术

摘要

赤潮作为一种长期存在的海洋灾害，不仅会给捕捞业、水产养殖和近海旅游造成严重的经济损失，还会通过多种方式导致海洋生物大量死亡，破坏生态环境，特别是毒素通过食物链，空气传播危及人类身体健康。因此，赤潮的监测和预防十分重要。要对赤潮进行预警和监测，首要需要对赤潮藻种进行准确的分类和鉴定，其次是建立快速准确的方法来检测藻种。鉴于赤潮藻个体微小、分类学复杂的特点和传统鉴定法的局限性，本研究将PCR技术和反向斑点杂交技术有效结合，建立了一种新型的检测方法——膜分类芯片检测技术，不仅可以达到种属间的区分，还有同时检测多种藻，有检测灵敏度高的优点。
　　研究选取了6种产毒的海洋微藻（剧毒卡尔藻、米氏凯伦藻、强壮前沟藻、利玛原甲藻、赤潮异湾藻和塔玛亚历山大藻）为研究对象，首先对它们的核糖体大亚基D1–D2区进行克隆测序，获得碱基序列；其次，将获得的序列应用生物信息学软件进行比对分析，目测确定序列特异性区域，作为探针序列；最后，采用斑点杂交对探针的特异性进行验证。
　　建立的膜分类芯片检测技术的检测流程如下：（1）探针加尾：对特异性探针加尾，以固定在膜上；（2）膜分类芯片的制备：在阵列设计好的尼龙膜上进行探针点样，并通过紫外交联固定，制备好膜分类芯片；（3）杂交靶序列的PCR扩增和标记：提取6种产毒微藻的基因组作为模板，并对核糖体大亚基D1–D2片段进行生物素标记的PCR扩增；（4）核酸杂交：将PCR扩增产物热变性并与膜分类芯片进行杂交；（5）显色：通过碱性磷酸酶偶联生物素抗体与生物素标记结合，以及酶介导BCIP/NBT显色反应，形成可见斑点。
　　对建立的膜分类芯片检测技术的相关参数进行了优化，包括探针的紫外交联固定时间、探针上样量、生物素标记产物杂交浓度、杂交时间、杂交温度和洗膜温度，优化结果如下：紫外交联0.5–1.0 min，探针上样量为15 ng，产物反应浓度150–300 ng/ml，杂交时间为2 h，杂交温度为44℃，洗膜温度为46–48℃。为了降低标记生物素的成本，采用生物素掺入标记、生物素引物标记和PCR-随机引物扩增标记三种方法，结果显示生物素引物标记法成本最低且芯片检测效果最好，因此，生物素引物标记法为最佳标记方法。此外，为了提高芯片检测灵敏度，采用三种细胞处理方法优化，包括CTAB提取DNA法、一管式植物DNA抽提试剂盒法和裂解缓冲液法，结果显示一管式植物DNA抽提法灵敏度最高，可以检测到0.5个细胞，但反应产物不易保存，CTAB法斑点灰度值最高，能检测到5个细胞，能长期保存，可根据需求进行选择。
　　进行了非目标基因组干扰实验，将非目标藻—热带骨条藻基因组与6种目标藻基因组的浓度以不同比例混合并进行了膜分类芯片检测，结果得出：非基因组不能干扰膜分类芯片技术的检测特异性。最后进行了模拟自然水样检测，将目标微藻与自然海水混合，稀释成6个不同的细胞梯度，进行膜分类芯片检测，结果显示：膜分类芯片技术可以检测模拟水样，不影响该技术的检测灵敏度。综上所述，膜分类芯片检测技术是一种快速准确的赤潮藻分子检测方法。

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第1章 绪论

1.1 赤潮概述

1.2 赤潮藻检测的分子技术

1.3 国内外研究进展

1.4 本课题研究内容及意义

第2章 产毒微藻的核糖体大亚基D1–D2区的克隆及特异性探针的设计

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第3章 膜分类芯片检测技术杂交条件优化

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第4章 膜分类芯片检测技术中靶序列的生物素标记方法优化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 小结

第5章 膜分类芯片检测技术的靶细胞处理方法优化

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4小结

第6章 非目标基因组的干扰和模拟自然水样实验

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.3 结果与讨论

6.4 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文及其它成果

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致谢