基于滚环扩增的海洋产毒藻类膜分类芯片检测技术

摘要

我国是一个赤潮多发国家，赤潮的爆发不仅会对海洋生态环境造成破坏，还会危害水产品安全，甚至威胁到人类的健康。因此，有必要建立一种有效的方法对赤潮藻尤其是产毒藻类进行实时监控。传统的藻类检测方法具有一定的局限性，而且以往建立的技术只能对单种赤潮藻进行检测，实用性较差。因此，本研究建立了一种产毒藻类的高通量检测新方法—滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA）-膜分类芯片检测技术。
　　本研究选取了8种海洋常见产毒微藻，包括包括海洋卡盾藻（Chattonella marina, Cm）、赤潮异湾藻（Heterosigma akashiwo, Ha）、米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi, Km）、强壮前沟藻(Amphidinium carterae, Ac）、剧毒卡尔藻（Karlodinium veneficum, Kv）、利玛原甲藻（Prorocentrum lima, Pl）、塔玛亚历山大藻（Alexandrlum tamarense, At）和链状亚历山大藻（A. catenella, Aa）作为测试对象，通过基因克隆对其进行分子鉴定。首先，提取目标藻的基因组 DNA，对其核糖体大亚基（ribosomal large subunit，LSU）D1-D2区进行PCR扩增，扩增产物纯化回收后与载体连接，并导入到大肠杆菌中进行克隆，获得的阳性克隆菌株用于商业测序，将测序结果进行BLASTn比对分析，确认藻种的正确性。
　　进一步根据各目标藻种的测序结果，下载亲缘关系较近或序列相似性较大物种的核酸序列，将其与目标藻种的LSU序列进行比对分析，获取种特异性序列，并以此为基础，根据探针设计原则设计各目标藻的特异性锁式探针(padlock probe，PLP）、通用引物P1和P2及分类探针cZip。
　　以海洋卡盾藻为研究对象，建立了该藻的RCA与试纸法检测技术。对RCA检测参数进行了优化，包括PLP连接时间和连接温度、RCA扩增时间和扩增温度，优化结果为：连接时间60 min，连接温度65℃，扩增时间60 min以及扩增温度61℃。对海洋卡盾藻PLP以及分类探针cZip进行了特异性验证，对RCA技术以及试纸法检测技术进行了灵敏度测试，并最终通过模拟自然水样对 RCA与试纸法检测技术进行了实用性验证。结果表明，本研究设计的海洋卡盾藻PLP及分类探针特异性较好，RCA与试纸法对海洋卡盾藻质粒的检测极限分别为10 copies/μL和1 copies/μL，并分别比PCR技术高2和3个数量级；PCR、RCA和试纸法对模拟自然水样的检测极限分别为103 cells、1 cell和0.1 cell，同样显示试纸法比RCA和PCR技术具有更高的检测灵敏度。
　　建立8种目标藻的RCA-膜分类芯片检测技术，建立流程为：膜芯片的制备→探针点样→RCA扩增和标记→核酸杂交→洗膜→抗体反应→洗膜→显色。首先选取24种测试藻种，对PLP和分类探针进行特异性验证，其中分类探针的特异性验证采用斑点杂交法，结果表明PLP和分类探针特异性较好；其次，对RCA-膜分类芯片检测技术的各条件进行了优化，包括PLP连接时间和温度、RCA扩增时间、RCA扩增温度、探针的紫外交联时间、探针上样量、RCA产物浓度、杂交时间及温度和洗膜温度，优化结果如下：PLP连接温度61℃，PLP连接时间70 min，RCA扩增温度64℃，RCA扩增时间50 min，紫外交联时间1 min，探针上样量10 ng，RCA产物浓度250 ng，杂交时间2 h，杂交温度44℃和洗膜温度50℃。
　　为与当前常用的PCR标记膜分类芯片的检测灵敏度进行比较，根据8种产毒微藻的LSU序列，设计分类探针，建立了目标藻的PCR-膜分类芯片检测技术。用不同浓度的含目标藻 LSU序列的质粒作为模板制备生物素标记 PCR和 RCA产物，并测试 RCA-膜分类芯片和 PCR-膜分类芯片的检测灵敏度，结果表明， PCR-膜分类芯片检测技术和 RCA-膜分类芯片检测技术所能检测的质粒浓度极限分别是100 copies/μL和10 copies/μL，RCA-膜芯片检测技术比PCR-膜芯片检测技术的灵敏度高1个数量级。
　　最后，以模拟自然水样为测试对象，对RCA-膜分类芯片检测技术进行实用性验证，并与 PCR-膜分类芯片检测技术进行比较，结果表明：RCA和 PCR-膜分类芯片检测技术均能对模拟自然样品中的目标藻进行有效检测，验证了本研究建立的检测技术的实用性，灵敏度测试显示，RCA-膜分类芯片检测技术所能检测的模拟自然水样中的藻细胞数是0.1 cell，比PCR-膜芯片在检测藻细胞数方面灵敏度高1个数量级。

目录

第1章 绪论

1.1 赤潮概述

1.2 赤潮藻的检测

1.3 基因芯片检测技术的国内外研究进展

1.4 本课题研究内容及意义

第2章 用于膜分类芯片检测研究目标藻种的鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 PLP、通用RCA引物及分类探针的设计

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 RCA技术结合试纸法对海洋卡盾藻的检测

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.6 小结

第5章 RCA-膜分类芯片检测技术的建立及RCA反应条件的优化

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

第6章 膜分类芯片检测技术的优化

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.3 结果

6.4 讨论

6.5 小结

第7章 RCA-膜分类芯片检测技术的灵敏度测试及实用性验证

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.3 结果

7.4 讨论

7.5 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢