大米蛋白ACE抑制肽制备及其膜高效分离技术的研究

摘要

相对于其它植物蛋白，大米蛋白具有很高的营养价值，但对于慢性肾脏病人来说仍然是一大负担，中恩（天津）医药科技有限公司拟开发一款脱蛋白大米，以满足肾脏病人对大米的需求并减轻他们的肾脏负担。本实验的主旨在于将脱除的大米蛋白回收，建立起高效的超滤回收方法，生产具有血管紧张素转换酶（ACE）抑制功效的大米蛋白肽。
　　首先选择了两株芽孢杆菌与原工艺生产使用的乳酸菌2-18作脱除蛋白的效果对比，实验结果表明芽孢杆菌Y、Y4-2和乳酸菌都能在大米里面生长达到108CFU/mL，并且产生蛋白酶，但是乳酸菌2-18脱蛋白能力要明显优于两株芽孢杆菌；将三株菌与胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶进行组合实验，结果显示乳酸菌2-18与胃蛋白酶、菠萝蛋白酶的组合蛋白脱除率最高达到91％。
　　回收液得到的肽液，经过经过过滤、微滤除去固形颗粒物和菌体等杂质后，测定了其基本组成成分，全蛋白、肽含量分别为0.66%±0.026%、0.63%±0.035%，灰分含量为7.3±0.096mg/10mL，透析后降到1±0.035mg/10mL。氨基酸分析显示，必需氨基酸占总氨基酸含量的39.62%，其SRC为91.05，远高于猪牛肉的SRC；通过分子量分布分析，肽的分子量主要在1000Da~1500Da之间，占总量的41.66%，在这个分子量范围的肽可能具有ACE抑制活性；然后测定了ACE抑制率，经过乳酸菌2-18、胃蛋白酶和菠萝蛋白酶水解后肽的ACE抑制率达到91.95%±6.45%；通过模拟胃肠消化，在胃肠中肽会有部分水解，且ACE抑制率下降。
　　由肽分子量分布结果，本研究预选1kDa、3kDa的超滤膜，1kDa的超滤膜的截留率为89.29%，远大于3kDa的超滤膜的65.69%；通过对压力、温度、物料浓度对膜通量的影响的探究，选择温度低、高水平40℃、50℃，压力低、高水平0.3MPa、0.4MPa，物料浓度低、高水平0.31%、0.63%进行Box-Behnken设计，确定的超滤的优化模型为：Y=30.92+2.56·A+4.7·B-0.58·C+0.9·A·B+0.0025·A·C+0.11·B·C-1.42·A2-1.22·B2-0.54·C2，方差分析和响应面分析表明：温度、压力对膜通量的影响极显著，而物料浓度、温度和压力的交互作用对膜通量的影响显著。用Design Expert软件对超滤条件进行优化，结合实际生产成本考量本研究选择超滤条件为50℃、0.4MPa和0.63%，该条件下理论值为35.43L/(h·m2)，实际测得膜通量为35.54±0.70L/(h·m2)；研究表明超滤膜的使用超滤周期为150min较好，反向清洗压力为0.2MPa，清洗时间为10min，这样能保持较好的膜通透性。
　　阳离子交换柱层析初步将肽液分离纯化成三个组分：AⅠ、AⅡ、AⅢ，经过Superdex peptide10/300GL凝胶过滤柱层析，将组分AⅠ分离纯化为七个组分：BⅠ、BⅡ、BⅢ、BⅣ、BⅤ、BⅥ、BⅦ，经过RE-HPLC的分离纯化，组分BⅤ被进一步分离纯化为CⅠ和CⅡ，对CⅠ进行了LC/MS和氨基酸分析，并通过与大米的谷蛋白序列进行对比初步确定了该肽的序列：Val-Val-Phe-Phe-Ala-Ala-Ala-Leu。