电融合技术构建高产燃料酒精的菌株及其高密度发酵

摘要

为得到既能直接利用木薯淀粉原料又能发酵高产酒精的菌株，本论文对最佳条件下制备的K氏酵母原生质体与黑曲霉(As3.4309)原生质体进行电融合，最终选育出一株性能稳定、高产酒精的融合子，且摸索出该融合子高细胞密度发酵产酒精的工艺验条件。 K氏酵母单倍体制备的最佳产孢培养基为：葡萄糖0.1％，酵母膏0.25％，NaAC·3H2O1.36％，琼脂2％，用HCl调pH值至6.0左右。在该培养基上28℃培养6d，其孢率为78.34％。K氏酵母原生质体形成与再生的优化条件为：菌龄8h，经0.1％β-巯基乙醇预处理10min及以0.8mol/L甘露醇为稳定剂，用1.5％蜗牛酶30℃下酶解2h，在该条件下K氏酵母原生质体形成率与再生率分别为72.9％、21.6％。黑曲霉其原生质体再生优化实验条件为：菌龄为12h，1.0％纤维素酶+0.5％蜗牛酶+0.5％溶菌酶，30℃下酶解3h，黑曲霉原生质体再生率达4.2％。 K氏酵母原生质体与黑曲霉原生质体紫外单亲灭活后电融合条件为：交变电场频率为1MHz，交变电场强度600v/cm，脉冲电场强度10kv/cm，脉冲宽度50μs，脉冲个数为5个。经平板初筛和发酵复筛得到一株性能稳定的融合子AK-2。该融合子的对数生长期为9h～21h。 融合子AK-2高细胞密度发酵产酒精工艺条件：融合子的发酵培养基为木薯(最佳粉碎度80目，料液比1:3.5，蒸煮温度100℃，蒸煮时间30min，α-淀粉酶添加量15U/g)，MgSO40.03％，KH2PO40.05％，CaCl20.02％，(NH4)2SO40.25％。融合子发酵条件为：转速150r/min，接种量10％，发酵温度32℃，初始pH值4.5；溶氧控制在50％，通氧时间控制为15h。在最佳的条件下融合子发酵，酒精度达到10.3％(v/v)，细胞密度达到3.4亿/mL(细胞干重为23.8g/L)，比优化前细胞密度和酒精产量分别提高了75.6％和17.4％。 10L发酵罐中，融合子AK-2高细胞密度发酵产酒精工艺和K氏酵母传统添加糖化酶发酵产酒精工艺进行比较，发现融合子高细胞密度产酒精能力略低于传统发酵工艺，但糖利用率高，残还原糖含量低，不需要糖化工艺，发酵周期缩短，减少了添加酶的成本，同时糖化和发酵在同一个反应器中进行，设备投资少，能耗降低，在工艺上有较大的优势。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

1.1燃料酒精工业发展状况

1.2原生质体融合技术

1.3高密度发酵技术

1.4木薯燃料酒精工业发展现状

1.5研究的目的及意义

1.6研究内容及方法

第2章原生质体的制备及电融合

2.1前言

2.2实验材料

2.2.1菌种

2.2.2主要器材

2.2.3主要药品

2.2.4主要溶液

2.2.5培养基

2.3实验方法

2.3.1 K氏酵母单倍体制备

2.3.2 K氏酵母原生质体制各

2.3.3黑曲霉原生质体制备

2.3.4电融合

2.3.5融合子的性能检测

2.3.6测定方法

2.4实验结果

2.4.1 K氏酵母单倍体制备实验结果

2.4.2 K氏酵母原生质体的制备及再生实验结果

2.4.3黑曲霉原生质体制备实验结果

2.4.4电融合

2.4.5融合子AK-2性能测定

2.5本章小结

第3章木薯原料的预处理

3.1前言

3.2实验材料

3.2.1菌种与原料

3.2.2主要仪器

3.2.3主要药品

3.2.4培养基

3.3实验方法

3.3.1木薯原料成分分析

3.3.2木薯干最佳粉碎度的确定

3.3.3发酵料液比的确定

3.3.4蒸煮温度与时间的确定

3.3.5液化酶添加量的确定

3.3.6测定方法

3.4结果与分析

3.4.1木薯原料成分分析

3.4.2木薯干最佳粉碎度的确定

3.4.3发酵料液比的确定

3.4.4蒸煮温度与时间的确定

3.4.5液化酶添加量的确定

3.5本章小结

第4章高密度发酵工艺的初探

4.1前言

4.2实验材料

4.2.1菌种与原料

4.2.2主要仪器

4.2.3主要药品

4.2.4培养基

4.3实验方法

4.3.1无机盐对发酵的影响

4.3.2添加氮源对酒精发酵的影响

4.3.3转速对发酵的影响

4.3.4接种量对发酵的影响

4.3.5温度对发酵的影响

4.3.6初始pH值对发酵的影响

4.3.7通氧对融合子发酵过程的影响

4.3.8 10L发酵罐溶氧条件的确定

4.3.9两种不同工艺发酵酒精的比较

4.3.10测定方法

4.4结果与分析

4.4.1无机盐对发酵的影响

4.4.2添加氮源对发酵的影响

4.4.3转速对发酵的影响

4.4.4接种量对发酵的影响

4.4.5温度对发酵的影响

4.4.6初始pH值对发酵的影响

4.4.7通氧对高融合子高细胞密度发酵的影响

4.4.8 10L发酵罐溶氧条件的确定

4.4.9两种不同工艺发酵酒精的比较

4.5本章小结

第5章总结与展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

致 谢

附 录