转基因大豆及其加工产品检测技术的研究

摘要

自1983年首例转基因作物(geneticallymodifiedcrops，GMCs)问世以来，其生物安全性(biosafety)问题便受到了广泛争论。同时，随着生物技术的发展，越来越多的GMOs(geneticallymodifiedorganisms)成为商品进入市场。由于其生物安全性，对GMOs的检测和对GMOs特性的叙述又引起了更多的关注。　　PCR检测方法在检测转基因食品材料上被证明具有特异性和灵敏性，例如对roundupreadysoybean，RR大豆的检测。本研究将PCR技术用于转基因大豆及其加工产品的检测，建立了定性PCR检测转基因大豆及其加工产品的方法，利用市场上购买的样品，进行了实际检测工作。　　为了确保能从大豆原材料和加工食品(初加工和深加工食品)中提取到高质量的模板DNA，降低PCR反应中的抑制物(例如加工食品中的可可粉成分)，本实验用改良的CTAB、SDS和试剂盒三种提取方法，并比较了它们之间的差异，试验结果发现：油脂类豆制品和发酵豆制品采用改良的SDS法提取基因组DNA较好，蛋白类豆制品采用改良的CTAB法提取基因组DNA较好，非发酵豆制品三种方法都可以，并以大豆特异性内源基因-大豆凝集素基因(lectin)为参照，对获得的DNA的可扩增性加以验证。　　本研究建立了转基因大豆及其加工产品常用的调控基因CaMV35S启动子、NOS终止子和目的基因CP4-EPSPS及其相互交叉基因序列的PCR检测技术，对PCR结果进一步用酶切和测序进行验证。针对41种样品材料进行检测。研究结果表明：本试验中PCR法的豆粕转基因检测检出下限为：重量稀释法分析转基因最低检测限为0.5％(w/w)。该实验方法操作简易，效率高，适用于对大豆及其加工产品的检测。　　根据目前外源基因旁侧序列对转基因植物的安全性是否有影响还不确定，利用反向PCR(invertedPCR，IPCR)方法，测定并分析了转基因豆粕(roundupreadysoybean)中外源基因的旁侧序列，该研究为今后对GMOs的生物安全性的进一步研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1转基因作物的发展概况

1.1.1转基因作物概述

1.1.2转基因作物的发展历程

1.1.3转基因作物在全球种植情况

1.1.4转基因大豆的发展概况

1.2转基因生物安全

1.2.1转基因产品的安全性评价

1.2.2转基因生物的潜在危险

1.3转基因产品的检测

1.3.1转基因产品的检测方法

1.3.2我国转基因产品检测技术研究进展

1.3.3国外转基因产品检测研究状况

1.3.4转基因产品检测技术的发展趋势

1.3.5深加工产品中转基因成分检测技术概况

1.4研究目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1检测样品

2.1.2菌株与质粒

2.1.3引物

2.1.4主要试剂

2.1.5主要实验仪器

2.1.6主要缓冲液及试剂的配制

2.2实验方法

第一部分：转基因大豆及其加工产品DNA的提取

第二部分：基因组DNA的PCR扩增检测

第三部分：IPCR克隆转基因豆粕(roundup ready soybean)的外源基因旁侧序列

3结果与分析

3.1转基因大豆及其加工产品DNA的提取

3.1.1大豆及其加工产品中DNA提取方法的比较

3.1.2转基因豆粕最低检测限分析试验

3.1.3转基因样品的PCR检测结果

3.2基因组DNA的PCR扩增检测

3.2.1 DNA质量检测

3.2.2试剂盒抗草甘磷（CP4-EPSPS）转基因的PCR检测

3.2.3 CaMV35S启动子的PCR扩增检测

3.2.4 NOS终止子、CaMV35S/CP4-EPSPS、CTP/CP4-EPSPS、CaMV35S/CTP和CP4-EPSPS的PCR扩增检测

3.3 PCR、IPCR产物目的片段的分子克隆与鉴定

3.3.1 PCR产物目的片段的分子克隆与鉴定

3.3.2 IPCR产物目的片段的分子克隆与鉴定

4讨论

4.1 DNA提取

4.1.1样品DNA提取实验结果分析

4.1.2影响DNA提取的因素

4.1.3 DNA提取过程分析

4.1.4 DNA质量分析

4.2检测方法

4.3 PCR

4.4 IPCR

5结论

致谢

参考文献

附录

英文缩略词表

攻读硕士期间发表的学术论文