膜分离技术用于乳酸菌菌体富集浓缩的研究

摘要

随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶发酵剂，对于推动我国乳酸菌发酵剂产业化进程，促进我国发酵乳制品工业的发展，具有重要的意义。菌体的富集浓缩是发酵剂制备的关键技术之一，目前工业生产中常用的是离心分离的方法，这种方法对菌体损伤大，回收率低，而且与菌体一起沉淀下来的丙酮酸盐和二乙酰等羰酰基化合物，会与细胞内的氨基反应，从而加速细胞死亡。本研究采用膜分离代替传统的离心分离来富集浓缩菌体，探讨该法是否可以弥补离心分离的不足。 研究内容： (1)通过对乳品科学教育部重点实验室保藏的3株保加利亚乳杆菌和3株嗜热链球菌进行生理生化鉴定。 (2)通过观察灭菌后优化培养基的状态和pH的测定，来确定乳清粉优化培养基灭菌前应调至的pH。 (3)以KLDS1.8501和KLDS3.8501两株菌为研究对象，通过最佳反应条件的确定，建立光吸收值与活菌数的线性回归方程，探讨MTT比色分析法用于快速细菌计数的可行性。 (4)通过试验比较不同孔径的膜渗透通量的大小及其衰减幅度，来确定使用陶瓷膜的类型。 (5)通过观察过滤过程中膜渗透通量和死亡率的变化，确定微滤膜的最佳工作条件。 (6)选择五种化学清洗剂：HNO3，NaOH，NaClO，Na-EDTA，SDS，分别进行单步化学清洗和两步化学清洗，确定最佳膜清洗方案。 (7)比较膜分离与离心分离两种方法的分离存活率、回收率，以及分离后的发酵活力。 实验结果： (1)通过生理生化实验，鉴定了菌株KLDS1.9201，KLDS1.9205，KLDS1.8501为保加利亚乳杆菌：菌株KLDS3.8501，KLDS3.0503，KLDS3.9207为嗜热链球菌。 (2)确定了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的乳清粉优化培养基灭菌前pH应分别调至6.6和6.9。 (3)若想用MTT法精确反映活菌数，一定要把KLDS1.8501的活菌数调到5.5×106～2.18×107CFU/mL之间，把KLDS3.8501的活菌数调到6.4×106～5.12×107CFU/mL之间。在最佳反应条件下，KLDS1.8501菌株的线性回归方程是y=1.222x-0.06;KLDS3.8501菌株的线性回归方程是y=5.759x+0.034。但在实际应用中，MTT比色分析法与平板菌落计数两种方法检测的活菌数差异显著。 (4)确定采用0.2μm的无机陶瓷膜对嗜热链球菌发酵液进行分离和浓缩。 (5)膜过滤嗜热链球菌的最佳工作条件为：操作压力0.15MPa，操作温度45℃。在这种操作条件下，对嗜热链球菌发酵液进行分离和浓缩，菌体存活率可达到90％。 (6)最佳清洗方案为：先用1％NaClO清洗15min，再用1.5％SDS清洗15min，通量恢复率可达到99％。(7)与离心分离相比，膜分离可以显著提高分离的存活率、回收率和发酵活力。 结论：MTT比色分析法只可以粗略的表示乳酸菌活菌数的变化趋势，但不能准确定量检测保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数量。膜分离技术可以用于乳酸菌菌体的富集浓缩，与离心分离法相比，膜分离具有菌体分离存活率高和分离后发酵活力高的优点。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 引言

1.1酸奶发酵剂的概述

1.1.1发酵剂对酸奶质量的影响

1.1.2发酵剂的分类及特点

1.1.3国内外乳酸菌发酵剂的研究现状

1.2活菌计数方法

1.2.1直接检测法

1.2.2间接检测法

1.2.3常用活菌计数方法的比较

1.3膜分离技术及其发展

1.3.1膜分离技术原理

1.3.2常用的膜分离过程

1.3.3膜的污染及清洗

1.3.4膜分离技术在发酵液后处理过程中的应用

1.3.5膜分离技术的展望

1.4试验的目的和意义

1.5本研究拟采取的技术路线

2 材料与方法

2.1试验材料

2.1.1原料

2.1.2主要试剂

2.1.3仪器设备

2.1.4无机陶瓷膜示意图

2.2乳酸菌的发酵培养

2.2.1菌种的活化与传代

2.2.2菌种的生理生化鉴定

2.2.3pH对优化培养基灭菌后状态的影响

2.2.4乳酸菌的培养方法及相关指标的测定

2.3MTT法测定乳酸菌活菌数的研究

2.3.1MTT法区分死、活乳酸菌的可行性分析

2.3.2MTT法测定乳酸菌活菌数最佳反应条件的确定

2.3.3光吸收值与活菌数的线性回归方程的确定

2.3.4MTT法的应用

2.4膜分离试验设计

2.4.1膜分离评价指标的定义及测定方法

2.4.2膜孔径的选择

2.4.3微滤工艺参数的确定

2.4.4膜清洗方法的确定

2.4.5膜分离与离心分离工艺的比较

2.5实验数据的分析与统计

3 结果与分析

3.1乳酸菌的鉴定及发酵培养

3.1.1生理生化鉴定结果

3.1.26％乳清粉培养基配置方法的确定

3.1.3优化培养基起始pH的确定

3.1.4灭菌后乳清粉溶液的状态随pH的变化

3.1.5生长曲线的绘制

3.2MTT试验结果

3.2.1MTT法区分死、活乳酸菌的可行性分析

3.2.2MTT法测定乳酸菌活菌数最佳反应条件的确定

3.2.3光吸收值与活菌数的线性回归方程的确定

3.2.4MTT法的应用

3.3膜分离试验结果

3.3.1微滤膜的选择

3.3.2微滤工艺参数的确定

3.3.3膜污染和膜清洗

3.3.4膜分离与离心分离效果的比较

4 讨论

4.1有关MTT法的讨论

4.1.1甲臜在DMSO溶剂中的最大吸收波长

4.1.2干扰物对OD570测定值的影响

4.1.3MTT法测定乳酸菌活菌数最佳反应条件的确定

4.1.4MTT法测定乳酸菌活菌数不可行的原因分析

4.1.5提高MTT法的灵敏度的建议

4.2有关膜分离的讨论

4.2.1微滤膜的选择

4.2.2微滤工艺参数的确定

4.2.3膜污染和膜清洗

4.2.3膜分离与离心分离效果的比较

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士期间发表的学术论文