2个新的鸽β-防御素5的克隆与生物学特性的初步研究

摘要

随着抗生素滥用所产生的负面影响日益增多，抗菌肽作为一种新型抗菌制剂渐渐引起了人们的关注，其稳定结构所发挥出的优势和独特的抗菌机制也成为了科学家们研究的热点。防御素是抗菌肽家族中的一员，具有高效广谱的杀菌能力，而且它的抗菌机制使病原菌不易产生耐药性，无论在先天性免疫还是获得性免疫中都起到重要作用，有着极大的开发潜力作为饲料添加剂应用于畜牧养殖业。
　　 从上一世纪八十年代开始，有关鸡、鸭、鹅、火鸡和企鹅等禽β-防御素的研究已经取得了突破性进展，但有关鸽β-防御素到目前为止还罕有报道。为进一步研究新的禽β-防御素，本试验采用RT-PCR方法，从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增到2个新的禽β-防御素(AvBD)基因。将测序结果与目前已知的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列进行同源性分析并绘制分子遗传进化树。测序结果得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp，编码66个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸。经遗传进化分析发现，该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高，分别为87.9％（骨髓）和78.8％（肝脏），两组氨基酸序列之间的同源性为83.3％。因此，将其分别命名为鸽AvBD5α（骨髓）和鸽AvBD5β（肝脏）。
　　 另外，这两个基因与哺乳动物β-防御素的同源性较低。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达，转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导表达，两个重组融合蛋白和标签蛋白GST进行纯化后，以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌，通过菌落计数法测定其体外抗菌活性。结果表明，重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白对这12种细菌均有较强的抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）。其中重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白对金黄色葡萄球菌、多杀性巴士杆菌、奇异变型菌、绿脓杆菌的抗菌活性相对其他较强，二者对鸡白痢沙门氏菌的抗菌活性较弱。重组鸽AvBD5α的抗菌活性与重组鸽AvBD5β无显著差异。另外，经检测，标签蛋白GST对12种细菌均无抗菌作用。在高盐浓度下，重组蛋白仍然对多杀性巴氏杆菌有抑制作用，但随着盐离子浓度的不断升高，重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白抗菌活性显著降低（p＜0.05或p＜0.01）。此外，重组鸽AvBD5α和重组鸽AvBD5β蛋白溶血活性极低，与阴性对照相比，无显著差异(p＞0.05)。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 抗菌肽简介

1．2 防御素的研究进展

1．2．1 防御素的结构和分类

1．2．2 防御素的生物学作用

1．2．3 防御素的应用

1．3 禽β-防御素的研究进展

1．3．1 禽β-防御素的分子结构

1．3．2 禽β-防御素的抗菌活性

1．3．3 禽β-防御素重组蛋白的制备

1．3．4 禽β-防御素的组织分布

1．3．5 禽β-防御素的诱导表达

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 菌株、载体质粒及重组蛋白

2．1．3 试剂与仪器

2．1．4 实验动物样品

2．1．5 引物

2．2 鸽AvBD基因的克隆与序列分析

2．2．1 组织总RNA的提取

2．2．2 反转录(RT)

2．2．3 聚合酶链式反应(PCR)

2．2．4 PCR产物的回收

2．2．5 PCR产物的连接

2．2．6 感受态细胞的制备

2．2．7 连接产物的转化

2．2．8 重组质粒的提取

2．2．9 重组质粒的鉴定

2．2．10 序列分析及同源性比较

2．3 重组鸽AvBD5蛋白在原核中的表达

2．3．1 原核表达载体的构建与测序

2．3．2 重组鸽AvBD5蛋白在大肠杆菌表达系统中的诱导表达

2．3．3 重组鸽AvBD5蛋白的纯化

2．3．4 重组鸽AvBD5蛋白浓度的测定

2．4 重组鸽AvBD5蛋白的抗菌活性测定

2．5 盐离子浓度对重组鸽AvBD5蛋白抗菌活性的影响

2．6 重组鸽AvBD5蛋白对鸡血红细胞的溶血活性

2．7 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 鸽AvBD5α和鸽AvBD5β基因的克隆

3．2 重组质粒的鉴定

3．3 测序结果与分析

3．4 鸽AvBD5α、5β基因的遗传进化分析

3．5 重组鸽AvBD5α和鸽AvBD5β蛋白的原核表达与纯化

3．5．1 表达用重组质粒pMD18-T-pigeon AvBD5α、5β的鉴定

3．5．2 重组表达质粒pGEX-AvBD5α和pGEX-AvBD5β的鉴定

3．5．3 重组鸽AvBD5α和鸽AvBD5β蛋白的原核表达与纯化

3．6 重组鸽AvBD5α和鸽AvBD5β蛋白的抗菌活性

3．7 盐离子浓度对重组鸽AvBD5α和鸽AvBD5β蛋白抗菌活性的影响

3．8 重组鸽AvBD5α和鸽AvBD5β蛋白对鸡血红细胞的溶血活性

4 讨论

4．1 鸽AvBD5α、5β基因的克隆与遗传进化的分析

4．2 鸽AvBD5α、5β的基因多态性

4．3 鸽AvBD5α、5β融合蛋白的原核表达

4．4 重组鸽AvBD5α、5β蛋白的抗菌作用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文