四个新的鸽β--防御素抗新城疫病毒作用机制的初步研究

摘要

禽β-防御素(AvBDs)是一类广泛存在于禽体内的内源性阳离子抗菌肽，主要特征结构是含有6个半胱氨酸残基构成的3对二硫键。抗菌肽是机体防御微生物入侵体内的第一道屏障。具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌的生物学作用，在禽类的先天性免疫系统中发挥重要作用。 本研究运用基因克隆的方法，分别从鸽的骨髓、法氏囊、骨髓和肝脏组织中扩增到4个新的鸽β-防御素基因。将推导的氨基酸序列与相关的β-防御素的氨基酸序列同源性比较分析，将其分别命名为鸽β-防御素1(AvBD1)、鸽β-防御素2(AvBD2)、鸽β-防御素7(AvBD7)和鸽β-防御素10(AvBD10)。将得到的序列与已发现的相关的禽防御素及部分哺乳动物序列分析表明:鸽β-防御素1编码区包含198个核苷酸，编码65个氨基酸残基，与鸭β-防御素1氨基酸同源性最高为81.54％;鸽β-防御素2编码区包含195个核苷酸，编码64个氨基酸残基，与火鸡β-防御素2氨基酸同源性最高为85.94％;鸽β-防御素7编码区包含204个核苷酸，编码67个氨基酸残基，与鸡、鸭β-防御素7氨基酸同源性最高为64.71％;鸽β-防御素10编码区包含204个核苷酸，编码67个氨基酸残基，与鹌鹑β-防御素10氨基酸同源性最高为82.35％。 分别将鸽β-防御素1、β-防御素2和β-防御素7基因亚克隆到表达载体pProEX-HTa上;鸽β-防御素10基因亚克隆到表达载体pProEX-HTb上，构建四个重组表达质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞，用IPTG进行诱导表达。Tricine-SDS-PAGE电泳表明:四个重组蛋白分子量约为13kD，表达产物均以包涵体的形式存在。重组蛋白经纯化后，选用四联球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌为检测菌，利用菌落计数法测定重组蛋白和His标签蛋白的抗菌活性、盐离子浓度对重组蛋白抗菌活性的影响以及溶血活性。结果显示:His标签蛋白几乎无抗菌活性，重组蛋白对检测菌具有不同程度的抑菌活性;高盐浓度显著降低了重组蛋白的抗菌活性;此外，这四个重组蛋白均无溶血活性。本试验还通过鸡胚接种和细胞培养的方法测定了这四个重组蛋白的体外抗新城疫病毒作用，结果表明:经重组蛋白中和后的病毒液接种鸡胚，与对照组相比，在不同时间点，鸡胚尿囊液中病毒含量降低，说明这四个重组蛋白具有抗新城疫病毒增殖的作用。 为探讨鸽AvBDs在抗新城疫病毒作用的信号转导机制。本研究用毒株新城疫病毒感染鸽，采用荧光定量PCR法，分别检测接种病毒前与接种病毒后3天、7天中这4个鸽β-防御素基因的表达量，以及Toll受体2、3、5、7、15基因在组织器官中的表达量。结果显示:经新城疫病毒诱导后，鸽β-防御素1基因在哈德氏腺、直肠、十二指肠、胰腺、腺胃和脑中的表达量显著上调;鸽β-防御素2基因在直肠、大肠、胰腺、腺胃中的表达量显著上调;鸽β-防御素7基因在胰腺、肺脏和肾脏中的表达量显著上调;鸽β-防御素10基因在脾脏和肝脏中的表达量显著上调。由此说明鸽AvBDs具有可诱导性，在感染前后的组织表达水平具有差异性。此外，结果分析表明，推测机体可能通过由Toll受体7作用介导的信号转导途径调控，激活天然免疫反应，从而诱导鸽β-防御素1、2、7和10的合成，在机体先天性免疫应答中起着重要的作用。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 抗菌肽简介

1．2 防御素的研究进展

1．2．1 防御素的定义

1．2．2 防御素的结构特征与分类

1．2．3 防御素的应用

1．3 禽AvBDs的研究进展

1．3．1 禽AvBDs的结构特征

1．3．2 禽AvBDs重组蛋白的制备

1．3．3 禽AvBDs的生物学特性

1．3．4 禽AvBDs的组织分布

1．3．5 禽AvBDs的诱导表达

1．4 Toll样受体的研究进展

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株及质粒载体

2．1．2 药品、试剂及配制

2．1．3 主要仪器

2．2 鸽β-防御素基因的克隆与序列分析

2．2．1 实验用动物及组织样品的采集

2．2．2 组织总RNA的提取

2．2．3 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

2．2．4 RT-PCR产物的回收

2．2．5 PCR产物的连接

2．2．6 感受态细胞的制备

2．2．7 连接产物的转化

2．2．8 碱裂解法质粒的提取

2．2．9 重组质粒的PCR鉴定与测序

2．2．10 基因序列分析及同源性比较

2．3 重组鸽β-防御素蛋白的原核表达

2．3．1 原核表达载体的构建

2．3．2 重组鸽β-防御素蛋白的诱导表达

2．3．3 重组鸽β-防御素蛋白的纯化

2．4 重组鸽β-防御素蛋白的抗菌活性测定

2．5 不同NaCl浓度对鸽β-防御素重组蛋白抗菌活性影响

2．6 重组鸽β-防御素蛋白的溶血试验

2．7 重组鸽β-防御素蛋白体外抗病毒活性的测定

2．7．1 毒株及实验动物

2．7．2 鸡胚接种实验

2．7．3 病毒TCID50测定

2．8 检测鸽β-防御素及TLRs经新城疫病毒诱导后的组织表达差异

2．8．1 实验用动物及组织样品的采集

2．8．2 荧光定量引物的设计

2．8．3 荧光定量标准品的制备

2．8．4 样品组织cDNA的制备

2．8．5 鸽AvBDs及TLRs基因的检测

2．9 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 鸽β-防御素基因的克隆

3．2 重组质粒的鉴定

3．3 测序结果及分析

3．4 鸽β-防御素基因的遗传进化分析

3．5 重组鸽β-防御素蛋白的原核表达

3．5．1 表达用重组表达质粒pMD18-T-Pigeon AvBDs鉴定

3．5．2 重组表达质粒pProEX-pigeon AvBDs的鉴定

3．5．3 重组鸽β-防御素蛋白的原核表达与纯化

3．6 重组鸽β-防御素及His标签蛋白的抗菌活性

3．7 不同NaCl浓度对鸽β-防御素重组蛋白抗菌活性的影响

3．8 重组鸽β-防御素蛋白的溶血试验

3．9 重组鸽β-防御素蛋白的抗病毒活性

3．10 经新城疫病毒诱导后，鸽β-防御素及TLRs在鸽组织器官中表达差异

4 讨论

4．1 鸽β-防御素基因克隆与遗传进化分析

4．2 重组鸽β-防御素融合蛋白的原核表达

4．3 重组鸽β-防御素蛋白的生物学特性

4．3．1 重组鸽AvBDs及His标签蛋白的抗菌活性

4．3．2 不同NaCl浓度对鸽AvBDs重组蛋白抗菌活性的影响

4．3．3 重组鸽β-防御素蛋白的溶血活性

4．3．4 重组鸽β-防御素蛋白抗病毒活性

4．4 鸽β-防御素及TLRs经新城疫诱导后的组织表达差异

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文