一种抗人α-防御素-1单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种抗人α‑防御素‑1单克隆抗体及其应用，属于生物医学技术领域。所述抗人α‑防御素‑1单克隆抗体包括重链和轻链，所述重链的可变区的三个互补决定区序列如SEQ ID NO.3‑5所示，所述轻链的可变区的三个互补决定区序列如SEQ ID NO.7‑9所示，本发明提供的抗人α‑防御素‑1单克隆抗体，特异性阻断了HNP1‑3与P2X7之间的作用，从而阻止HNP1‑3引起的血管内皮细胞的死亡，为开发预防或治疗脓毒症的药物提供一种新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗人α-防御素-1单克隆抗体及其应用。

背景技术

防御素是生物体产生的一类有直接杀菌作用和免疫调节作用等多种生物学功能的阳离子抗菌肽，是机体固有免疫的重要组成部分。根据防御素分子内二硫键构成的不同，人防御素分为-防御素和-防御素。根据人-防御素来源的不同，又分为人-防御素1-4(又称人中性粒细胞肽1-4，HNP1-4)和人-防御素5-6(又称人防御素5-6，HD5-6)，前者主要来自中性粒细胞，后者主要来自小肠潘氏细胞。其中HNP1-3分子之间的差异很小，仅N端1个氨基酸残基不同，因此常将其作为一个整体进行研究。HNP1-3约占中性粒细胞嗜天青颗粒蛋白的30％-50％，是中性粒细胞在感染、炎症过程中最早释放的警报素之一。

脓毒症(Sepsis)是感染引起的机体反应异常导致危及生命的器官功能损害，进一步可发展为脓毒性休克和多器官功能损害，是一种发病率高、死亡率高、医疗费用高的疾病。脓毒症的发病机制与早期炎症反应的过度激活、晚期免疫功能的抑制、凝血/抗凝系统失平衡以及血管内皮屏障功能障碍等密切相关。目前脓毒症尚无有效特异的治疗手段。既往研究发现，脓毒症发生后，血浆HNP1-3浓度升高，提示其在脓毒症发生发展中有重要作用。编码HNP1-3的基因DEFA1/DEFA3的拷贝数与脓毒症器官功能障碍的发生密切相关，高拷贝数DEFA1/DEFA3基因是脓毒症器官功能障碍的独立危险因素。而且，携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠脓毒症后死亡率明显增加，器官损害加重，血管通透性增高，血管内皮细胞焦亡(pyroptosis)增加。进一步研究发现，高浓度HNP-1能与内皮细胞P2X7受体(P2X7受体是对二价阳离子有较强选择性的ATP门控的离子通道，参与细胞信号转导，介导细胞毒性作用，活化并诱导宿主细胞死亡)相作用，通过一系列信号通路，激活caspase-1炎性小体，导致内皮细胞焦亡。

迄今为止，临床上还没有治疗脓毒症的药物。根据患者的遗传信息，使用抗体特异性阻断HNP-1与P2X7之间的作用为脓毒症的治疗提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人α-防御素-1的抗体，能够特异性阻断HNP-1与P2X7之间的作用，从而阻止下游炎性小体的活化和细胞焦亡，使之成为一种可以治疗脓毒症的药物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明针对HNP-1分子上与P2X7之间发生作用的氨基酸序列设计了抗原序列Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala，利用杂交瘤技术并筛选获得能够特异性阻断HNP-1与P2X7之间作用的单克隆抗体。

本发明提供了一种抗人α-防御素-1单克隆抗体，包括重链和轻链，所述重链的可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1：Gly-Leu-Asn-Ile-Lys-Asp-Thr-Phe-Met-His；

CDR2：Arg-Ile-Asp-Pro-Ala-Ile-Gly-Tyr-Thr-Lys-Tyr-Asp-Pro-Lys-Phe Gln-Gly；

CDR3：Trp-Pro-Leu-Ile-Ser-Thr-Ile-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Ser；

所述轻链的可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1：Arg-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Gly-Tyr-Ser-Tyr-Met-His；

CDR2：Leu-Val-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser；

CDR3：Gln-His-Ile-Arg-Glu-Leu-Thr-Arg-Ser。

作为优选，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以通过利用筛选获得的杂交瘤细胞注射动物腹腔，从腹水中纯化获得高亲和力的单克隆抗体；也可以通过基因克隆及蛋白原核表达技术获得。

本发明还提供了编码所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO.10所示的编码所述重链可变区的核苷酸序列和如SEQ ID NO.11所示的编码所述轻链可变区的核苷酸序列。

本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体与氨基酸序列为Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala的多肽特异性结合。

研究证明本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体能够与人α-防御素-1特异性结合，两者亲和力(Kd)达到4.02×10^-8M。由于HNP-1、HNP-2和HNP-3分子之间的差异很小，仅N端的1个氨基酸残基不同，本发明提供的单克隆抗体是针对HNP-1的第二位氨基酸残基开始的氨基酸序列作用，因此，本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以应用于制备检测人α-防御素-1、人α-防御素-2或人α-防御素-3的试剂盒。

研究证明本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体能够与HNP-1特异性结合，进而阻断HNP-1与P2X7受体的结合，因此，本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体也可以应用于制备阻断HNP-1、HNP-2或HNP-3与P2X7受体之间作用的药物。

研究证明本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体特异性阻断HNP-1上与P2X7受体结合的部位，阻止炎性体的活化，阻止内皮细胞焦亡，从而发挥对脓毒症的保护作用。因此，本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以应用于制备阻断血管内皮细胞焦亡的药物。

研究证明本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体能够显著改善携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的脓毒症模型预后，发挥了显著的治疗作用。因此，本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体可以应用于制备预防或治疗脓毒症的药物。

本发明还提供了一种预防或治疗脓毒症的药物组合物，包括有效剂量的所述的抗人α-防御素-1单克隆抗体和药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明具备的有益效果：

(1)已有的HNP-1抗体主要目的是作为分子生物学实验的一抗来使用，本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体，特异性阻断了HNP1-3与P2X7之间的作用，从而阻止HNP1-3引起的血管内皮细胞的死亡，为开发预防或治疗脓毒症的药物提供一种新的思路。

(2)本发明提供的抗人α-防御素-1单克隆抗体廉价易得，可以大规模生产，十分有利于开发成为治疗脓毒症的药物。

附图说明

图1为Western-blot方法检测炎性小体caspase-1活化水平。

图2为细胞上清中乳酸脱氢酶含量。

图3为抗HNP-1单克隆抗体改善携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠的脓毒症预后。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、多肽抗原表位设计与合成

从NCBI获取HNP-1和P2X7的蛋白序列，采用同源模拟和分子对接等方法综合预测HNP-1蛋白与P2X7作用的可能特异性位点，设计抗原多肽序列HNP-1-N28：Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO.1)，委托中肽生化有限公司进行多肽合成，并与KLH偶联为KLH-HNP-1-N28。

2、单克隆抗体制备

用KLH-HNP-1-N28免疫8周龄BALB/C小鼠。免疫方式为：首次免疫以皮下注射KLH-HNP-1-N28(注射剂量0.1mg/只，加弗氏完全完全佐剂)，首免后第21天再次加强免疫(注射剂量0.05mg/只，加弗氏不完全佐剂)，其后每2周如此加强免疫2次，再间隔2周后按常规方法进行脾脏免疫，3d后，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。7d后，以抗原包被的酶标板，间接ELISA法筛选阳性克隆。经筛选后，选择1株抗体效价最高的细胞制备腹水。

3、小鼠腹水的制备及单克隆抗体的纯化

以0.5mL/只的剂量腹腔注射石蜡油，1周后腹腔注射杂交瘤细胞(5×10⁶个细胞/只)，接种细胞10d后，抽取腹水，5000rpm离心收集上清液，用Protein>

4、抗HNP-1单克隆抗体与HNP-1的亲合力检测

该实验使用生物膜干涉技术在Octet K2system上检测二者之间的相互作用。实验在37℃条件下黑色96微孔板中进行。实验之前，先将aminopropylsilane生物传感器(ForteBio)在PBS中浸润10分钟并随后在新的PBS中平衡30秒。用aminopropylsilane生物传感器捕获抗体后，在含0.02％Tween-20的PBS中平衡240秒。随后，将抗HNP-1单克隆抗体与浓度分别为500nM、250nM、125nM、62.5nM和31.25nM的HNP-1作用150秒。最后，在含0.02％Tween-20的PBS中解离100秒。获得结合-解离曲线，用Octet数据分析软件(ForteBio)计算获得平衡解离常数。实验结果如表1所示。

表1.抗HNP-1单克隆抗体与HNP-1的亲合力检测

KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)4.02E-082.08E+058.37E-03

上述实验结果表明，抗HNP-1单克隆抗体与HNP-1有较强的亲和力。

5、抗HNP-1单克隆抗体阻断HNP-1诱导MLMEC细胞焦亡的作用

将小鼠肺微血管内皮细胞(MLMECs)在含10％胎牛血清的DMEM培养基、5％二氧化碳环境、37℃条件下培养。在实验前一天，将细胞按2×10⁵个/孔接种于12孔板中，过夜培养后，用1μg/ml的LPS和100ng/ml的IFN-γ进行刺激，48小时后，吸去上层培养基，并用新鲜的纯DMEM培养基冲洗两次，并于新鲜的纯DMEM培养基中继续培养。同时将HNP-1与抗HNP-1单克隆抗体、或小鼠IgG在37℃孵育2小时后，将其加入至上述细胞中，继续刺激孵育，并以HNP-1作为对照。24小时后，裂解细胞，采用western-blot方法检测炎性小体caspase-1活化水平，结果如图1所示；同时检测细胞上清中乳酸脱氢酶含量，结果如图2所示。

上述实验结果表明，在炎症因子活化的血管内皮细胞中，抗HNP-1单克隆抗体能减轻HNP-1对炎性小体caspase-1的激活，同时减少细胞乳酸脱氢酶的释放，从而阻断HNP-1诱导的血管内皮细胞的焦亡。

6、抗HNP-1单克隆抗体改善携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠的脓毒症预后

取8-10周龄、雄性、携带48个拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠，采用盲肠结扎穿孔(CLP)方法复制脓毒症模型。具体方法如下：小鼠经腹腔注射400mg/kg氯胺酮麻醉后，在下腹部经1.5厘米长的纵向切口暴露盲肠，用4-0丝缝线结扎盲肠远端，再用22号针穿刺。穿刺后，轻轻挤压盲肠。然后将盲肠置入腹腔，切口用手术缝合封闭。手术结束后，按每20克体重皮下注射1ml的生理盐水。为观察抗体的治疗效果，在模型后即刻、24小时和48小时后，将300μg抗HNP-1单克隆抗体通过尾静脉连续注射至小鼠体内。对照组小鼠以相同的方式给予等量的生理盐水(normal sodium,NS)或小鼠IgG(Sigma-Aldrich)。每6至8小时评估各组小鼠死亡率。

结果如图3所示，实验结果表明，携带高拷贝数DEFA1/DEFA3基因的转基因小鼠罹患脓毒症后，给予抗HNP-1单克隆抗体治疗能明显提高小鼠的生存率。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种抗人α-防御素-1单克隆抗体及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala

1 5

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Thr

202530

Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ile Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

505560

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Lys Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65707580

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Trp Pro Leu Ile Ser Thr Ile Val Glu Pro Phe Thr Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Leu Asn Ile Lys Asp Thr Phe Met His

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ile Asp Pro Ala Ile Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 1015

Gly

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Pro Leu Ile Ser Thr Ile Val Glu Pro Phe Thr Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 1015

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

202530

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

354045

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

505560

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65707580

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

859095

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

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<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

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<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaggtgaagc tggtggagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggcct caacattaaa gacaccttta tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgattggtta tactaaatat 180

gacccgaaat tccagggcaa ggccactata aaatcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatggccc 300

ctcatttcta caatagtaga accttttact tcctggggcc aagggactct ggtcactgtc 360

<210> 11

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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