培养条件对保加利亚乳杆菌蛋白水解体系关键酶基因表达影响的研究

摘要

乳酸菌作为发酵剂已经广泛应用于乳制品生产加工过程中。由于乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白质，必须通过蛋白水解体系将外源蛋白水解为游离氨基酸，供菌体正常生长需要。乳酸菌的蛋白水解体系包括胞外酶、转运系统和胞内肽酶三个部分。首先，胞外酶将外源蛋白质水解为多肽;多肽由转运系统运送至胞内;再由胞内肽酶将其水解为游离氨基酸。因此，蛋白水解体系中各种蛋白酶的活性及其基因的表达情况直接影响乳酸菌发酵剂的品质。蛋白水解体系中各种蛋白酶基因的表达不仅在不同菌株之间和不同生长阶段存在差异，还受到氮源的种类和含量、培养基初始pH和培养温度的影响。
　　 本实验选取蛋白水解能力较高的保加利亚乳杆菌，对其蛋白水解体系中部分关键酶基因的表达情况进行研究。菌体经活化后分别在正常液体MRS培养基、N缺乏MRS培养基和添加酪蛋白胨的MRS培养基中培养12h后备用，正常液体MRS培养基的初始pH值分别调至5.6、5.9、6.2和6.5，培养温度分别设置为30℃、37℃、42℃和45℃。利用实时荧光定量PCR技术测定目的基因(OppD、PrtB、PepC、PepF、PepQ、PepX、PepT)在不同菌株之间、不同生长时期、不同氮源、不同初始pH和不同温度培养下的表达量，分析保加利亚乳杆菌蛋白水解体系中关键酶基因表达的变化规律。
　　 试验结果表明，保加利亚乳杆菌蛋白水解体系中关键酶基因的表达在不同菌株之间存在显著差异(p＜0.05)，但是未呈现一定的规律性。
　　 随着菌体的不断生长，关键酶基因的表达水平呈现显著的下调趋势(p＜0.05)。各目的基因在对数初期(6h)的表达量是实验中选取四个时间点中的最大值;随着菌体的不断生长，到对数中期(12h)和对数末期(18h)时，表达量与对照组(6h)相比，显著下调;在培养时间18h时，各目的基因的下降幅度与对照组相比均较大，平均下降了15.6倍，差异极显著(p＜0.01)。到稳定期(24h)时各基因的表达量降到最低，与对数初期的表达量相比平均下降了34倍，差异极显著(p＜0.01)。
　　 在N缺乏培养条件下，培养12h,OppD、PrtB和PepF的表达量与正常状态培养下（对照组）相比显著上调，平均分别上调1.7倍、2.4倍和3.2倍。而其他基因的表达水平在不同菌株之间呈现显著差异。在添加酪蛋白胨的培养条件下，各目的基因的表达水平与对照组相比均显著下调。
　　 培养基的初始pH对目的基因表达也存在显著影响。在部分菌株(08006、08007、08012、08016)中，各基因的表达水平随着pH值的升高而升高。其中，各目的基因在初始pH6.5时的表达量与对照组(pH5.6)相比上调了3.9-10.0倍。而在其他菌株(08014、08015、08017)中各目的基因的表达量与对照组(pH5.6)相比显著下降，在pH5.9时平均下调了2.1倍:但是，在pH5.9、pH6.2和pH6.5之间的变化较平稳。由此看来，基因的表达水平受到诸多因素的影响，并且在菌株之间存在显著差异.
　　 培养温度过高(45℃)，导致菌体生长过快，较先进入稳定期，因此基因的表达量与低温度培养时显著下调，与对照组(30℃)相比下调幅度为2.0-10.7倍，这与不同生长阶段基因的表达结果相符。培养温度过低，对于部分菌体来说，抑制其生长，同样导致基因的水平降低。
　　 综上所述，保加利亚乳杆菌蛋白水解体系中关键酶基因在转录水平上的表达情况在同一菌种不同菌株之间存在显著差异，并且基因的表达量从菌体生长的对数初期到稳定期呈现显著下调的趋势。此外，菌体培养环境中氮源含量及种类、初始pH和培养温度对基因表达有显著影响。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 乳酸菌蛋白水解体系简介

1．2．1 胞外酶

1．2．2 转运系统

1．2．3 胞内肽酶

1．2．4 乳酸菌的蛋白水解活性

1．3 乳酸菌蛋白水解体系国内外研究现状

1．4 基因表达的研究方法

1．5 课题意义

1．6 课题内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基及培养条件

2．1．3 化学药品

2．2 实验设备

2．3 实验方法

2．3．1 菌株生长曲线的测定

2．3．2 基因表达的检测方法

2．3．3 关键酶基因及管家基因的确定

2．3．4 实时荧光定量PCR引物设计与合成

2．3．5 RNA的提取

2．3．6 反转录合成cDNA

2．3．7 实时荧光定量PCR

2．3．8 实时荧光定量PCR数据处理分析

2．3．9 不同条件下关键酶基因的表达测定

3 结果与分析

3．1 RNA的数量和质量

3．2 实时荧光定量PCR结果

3．3 不同菌株之间关键酶基因的表达情况分析

3．4 不同生长阶段关键酶基因的表达情况分析

3．4．1 保加利亚乳杆菌生长曲线

3．4．2 关键酶基因在菌株不同生长阶段的表达情况分析

3．5 不同氮源培养下关键酶基因的表达情况分析

3．6 不同初始pH培养下关键酶基因的表达情况分析

3．7 不同温度培养下关键酶基因的表达情况分析

4 讨论

4．1 不同菌株之间关键酶基因的表达情况

4．2 培养时间对关键酶基因表达的影响

4．3 氮源对关键酶基因表达的影响

4．4 初始pH对关键酶基因表达的影响

4．5 温度对关键酶基因表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文