木瓜蛋白酶水解和磷酸化修饰对大豆分离蛋白溶解性的影响

摘要

大豆分离蛋白以其蛋白质含量高，不含胆固醇，并且具有凝胶性、乳化性、持水持油等多种功能特性被广泛应用在食品加工领域。目前国内生产的大豆分离蛋白同质化，功能性以凝胶性为主，主要应用在火腿肠等肉制品中，高溶解性、高乳化性等功能蛋白品种很少，且功能稳定性差，尤其酸性条件下高溶解性大豆分离蛋白更是未见，大大地限制大豆分离蛋白在食品工业中的广泛应用。本研究针对酸性条件下大豆分离蛋白溶解性差的问题展开研究工作，旨在通过改性技术提高大豆分离蛋白在酸性条件下的溶解性，为大豆分离蛋白在酸性饮料中的应用提供理论支撑。主要研究内容及结果如下: 1.大豆分离蛋白改性方法选择。 通过对比酶改性、磷酸化改性、酶解-磷酸化复合改性、磷酸化-酶解复合改性四种改性方法下的SPI在等电点处的溶解性，确定最佳改性方法。结果表明酶解-磷酸化复合改性SPI在等点处的溶解性大于酶改性SPI、磷酸化改性SPI和磷酸化-酶解复合改性SPI。故选择酶解-磷酸化复合改性方法修饰大豆分离蛋白。 2.木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白条件优化。 通过单因素试验分别考察底物浓度、反应温度、反应pH、加酶量、反应时间对大豆分离蛋白的NSI值和DH值的影响。在单因素试验的基础上，进行正交实验，以NSI值为评价指标，各因素对NSI值影响大小依次为加酶量＞pH＞酶解温度＞酶解时间，确定最佳酶解工艺条件为:加酶量3500U/g、反应pH7.5、酶解时间120min、酶解温度60℃。此条件下大豆分离蛋白的NSI值为86.2％、DH为7.89％。 3.磷酸化修饰大豆分离蛋白酶解液条件优化。 通过单因素实验分别考察STP添加量、反应温度、反应pH、反应时间对大豆分离酶解液的含磷量及在pH4.5时的溶解性的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面分析优化反应条件，以NSI值为响应值，结果表明:各因素对NSI值的影响大小依次为反应温度＞反应时间＞STP浓度＞pH，回归方程的预测值和试验值差异不显著，所得回归模型拟合情况良好，达到设计要求。最佳磷酸化条件为:反应pH为8.45，反应温度为39.83℃、STP浓度为6.87％，反应时间为3.24h，此条件下制备的复合改性大豆分离蛋白在pH4.5时的NSI值为63.88％，含磷量为9.80mg/g。 4.酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白的功能性评价及结构分析。 研究结果表明，在pH2～9之间，酶解-磷酸化复合改性SPI的溶解性显著提高，等电点由4.5左右移至3.5左右，在pH4.5处的溶解性由原来的2.98％提高至63.88％，酶解-磷酸化复合改性SPI的乳化性略低于未改性SPI，但高于酶改性SPI的乳化性。酶解-磷酸化复合改性SPI相对于未改性SPI吸油性升高，保水性降低。傅里叶红外光谱分析证明了磷酸化改性引进一定量磷酸根，磷酸根主要是连在蛋白质侧链的氮原子上。电镜扫描看出SPI表面平整、结构紧凑，酶解-磷酸化复合改性SPI呈多孔状、结构疏松。与未改性SPI相比，酶解-磷酸化复合改性SPI的游离巯基含量升高、二硫键含量降低。 本研究通过采用酶法水解和磷酸化复合改性，解决了大豆分离蛋白在酸性条件下的溶解性差的关键技术，并优化了酶法-磷酸化复合改性大豆分离蛋白制备工艺条件，为功能性大豆分离蛋白的生产提供了理论基础和技术支撑。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 大豆分离蛋白的组成及其营养价值

1．1．1 大豆分离蛋白的组分

1．1．2 大豆分离蛋白的营养价值

1．2 大豆分离蛋白的功能特性

1．2．1 溶解性

1．2．2 水合性质

1．2．3 界面性质

1．2．4 黏度

1．3 蛋白质改性技术的研究进展

1．3．1 物理改性

1．3．2 酶法改性

1．3．3 化学改性

1．3．4 基因工程改性

1．4 蛋白质磷酸化改性

1．4．1 蛋白质磷酸化改性的原理

1．4．2 磷酸化试剂简介

1．4．3 国内外蛋白质磷酸化改性的研究状况

1．5 研究的目的与意义

1．6 本研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 原料和主要试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 研究工作的技术路线

2．2．2 大豆分离蛋白基本成分的测定

2．2．3 蛋白酶活力的测定

2．2．4 水解度的测定

2．2．5 磷酸化程度的测定

2．2．6 氮溶解指数(NSI)的测定(GB／T5511-2003)

2．2．7 大豆分离蛋白改性方法的选择

2．3 分析方法

2．3．1 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白功能性质的测定

2．3．2 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白结构分析

2．4 数据统计方法

3 结果与分析

3．1 大豆分离蛋白组分分析

3．2 蛋白酶活力的测定

3．2．1 酪氨酸标准曲线

3．2．2 酶活力的测定

3．3 亮氨酸和磷标准曲线绘制

3．3．1 亮氨酸标准曲线

3．3．2 磷标准曲线

3．4 大豆分离蛋白改性方法的确定

3．5 木瓜蛋白酶水解条件对大豆蛋白溶解性的影响及酶解条件优化

3．5．1 底物浓度对大豆分离蛋白NSI及DH的影响

3．5．2 pH对大豆分离蛋白NSI及DH的影响

3．5．3 反应温度对大豆分离蛋白NSI及DH的影响

3．5．4 酶添加量对大豆分离蛋白NSI及DH的影响

3．5．5 反应时间对大豆分离蛋白NSI及DH的影响

3．5．6 木瓜蛋白酶最佳水解工艺优化

3．6 磷酸化修饰大豆分离蛋白酶解液溶解性的影响及磷酸化条件优化

3．6．1 多聚磷酸钠浓度对大豆分离蛋白酶解液的氮溶解指数及含磷量的影响

3．6．2 反应pH对大豆分离蛋白酶解液的氮溶解指数及含磷量的影响

3．6．3 反应温度对大豆分离蛋白酶解液的氮溶解指数及含磷量的影响

3．6．4 反应时间对大豆分离蛋白酶解液的氮溶解指数及含磷量的影响

3．6．5 Box-Benhnken响应面法优化磷酸化反应条件

3．7 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白的功能性评价及结构分析

3．7．1 酶解-磷酸化复合改性对大豆分离蛋白溶解性的影响

3．7．2 酶解-磷酸化复合改性对大豆分离蛋白乳化性的影响

3．7．3 酶解-磷酸化复合改性对大豆分离蛋白保水性的影响

3．7．4 酶解-磷酸化复合改性对大豆分离蛋白吸油性的影响

3．7．5 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白傅里叶红外光谱(FTIR)的分析

3．7．6 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白电镜扫描分析

3．7．7 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白巯基含量分析

4 讨论

4．1 大豆分离蛋白改性方法的选择分析

4．2 酶解-磷酸化复合改性对大豆分离蛋白溶解性影响分析

4．3 酶解-磷酸化复合改性对大豆分离蛋白乳化性影响分析

4．4 酶解-磷酸化复合改性大豆分离蛋白结构分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文